国家自然科学基金(21276108)
- 作品数：11 被引量：18H指数：2
- 相关作者：陈海琴陈卫陈永泉顾震南张灏更多>>
- 相关机构：江南大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的酶学性质被引量：1
- 2016年
- 【目的】探讨卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的性质。【方法】克隆卷枝毛霉中编码苹果酸酶同工酶V的mel基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His标签纯化获得了高纯度的重组酶BLME1,并进行酶学性质分析。【结果】该重组酶最适pH为8.0,最适温度为33℃,在此条件下酶活达到92.8 U/mg,对底物L-苹果酸和NADP^+的米氏常数K_m值为0.74960±0.06129 mmol/L和0.22070±0.01810 mmol/L,最大反应速度V_(max)分别为72.820±1.077 U/mg和86.110±1.665 U/mg。金属离子Mg^(2+)、Mn^(2+)、Co^(2+)、Ni^(2+)可以激活BLME1的活性,而Ca^(2+)、Cu^(2+)对BLME1活性则有抑制作用,中间代谢产物草酰乙酸和α-酮戊二酸也会抑制BLME1的活性,但琥珀酸却对BLME1有激活作用。【结论】本实验调查了卷枝毛霉苹果酸酶同工酶V的最适反应温度和pH、动力学参数,以及各种金属离子和中间代谢产物对酶活力的影响,这为以后深入研究该苹果酸酶的功能提供了理论依据和参考。
- 张映曈陈海琴宋元达张灏陈永泉陈卫
- 关键词：苹果酸酶酶学性质金属离子中间代谢产物
- 动物双歧杆菌肌球交叉反应抗原MCRA酶学功能的研究
- 2012年
- 目的:将肌球蛋白交叉反应抗原基因(Myosin cross reactive antigen,MCRA)在毕赤酵母中重组表达,对其酶学功能进行研究。方法:利用动物双歧杆菌BB-12(Bifidobacterium animalissubsp.lactis BB-12)的肌球交叉反应抗原(MCRA)基因序列特征设计引物进行PCR扩增后克隆至毕赤酵母表达载体pPinkα-HC,电转化获得PichiaPinkTM重组菌。通过SDS-PAGE和Westernblot检测重组蛋白的表达情况,GC-MS分析重组菌的脂质组成情况,最终确定重组蛋白的活性及其催化特性。结果:SDS-PAGE及Western blot结果表明动物双歧杆菌BB-12的MCRA蛋白在重组毕赤酵母菌PichiaPinkTMpPinkα-HC-MCRA中成功表达且定位至细胞膜,大小为82 kDa。GC-MS结果显示,添加底物亚油酸培养基后,重组菌将亚油酸转变为羟基化衍生物,产物为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸(10-HOE)。结论:这是首次对该类蛋白成功定位后对其酶学功能进行研究,动物双歧杆菌BB-12的MCRA基因首次在毕赤酵母中实现了活性表达,产物为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸。
- 杨波陈海琴宋元达张灏陈卫
- 关键词：亚油酸毕赤酵母表达系统
- 高山被孢霉ω-3脂肪酸脱饱和酶基因在麦胚无细胞蛋白质合成系统中的表达被引量：1
- 2016年
- 无细胞蛋白质合成系统具有快速、方便等特点,能表达对活细胞具有一定毒性的膜蛋白和抗菌肽,近年来被广泛应用。以来自产油丝状真菌高山被孢霉多不饱和脂肪酸合成途径中的关键膜结合酶——ω-3脂肪酸脱饱和酶为研究对象,构建了适宜体外表达ω-3脂肪酸脱饱和酶的表达载体p IVEX WG1.4-FADS15,并利用麦胚无细胞蛋白质合成系统实现了对该基因的高效表达。同时,通过在麦胚无细胞蛋白质合成过程中添加脂质体的方法,将所表达的膜蛋白正确定位至脂质体磷脂双分子层,以便目标蛋白质的正确折叠。研究结果显示,在此实验条件下目标蛋白质的表达量达1.8 mg/m L,经碘海醇密度梯度超速离心纯化后,该蛋白质的纯度可以达到90%以上。研究结果为后续对该酶进行催化特性研究和蛋白质晶体结构解析奠定了基础。
- 杨芹陈海琴陈思顾震南张灏陈永泉陈卫
- 关键词：高山被孢霉蛋白纯化
- 植物乳杆菌肌球交叉反应抗原MCRA的克隆表达及功能鉴定被引量：1
- 2013年
- 根据NCBI中已报道亚油酸异构酶基因的序列特征从植物乳杆菌ZS2058克隆获得了产CLA的关键酶基因肌球交叉反应抗原MCRA,构建表达载体后,在大肠杆菌中实现了表达,SDS-PAGE和Western Blot检测结果为胞内可溶表达,其大小约为67ku,将MCRA蛋白进行亲和层析后进行功能鉴定,GC-MS结果显示此蛋白能将亚油酸转化为羟基化衍生物10羟基-顺12-十八碳烯酸,将油酸转化为10-羟基-十八碳酸。
- 杨波陈海琴张白曦宋元达陈永泉陈卫张灏
- 关键词：亚油酸共轭亚油酸
- 高山被孢霉Δ6Ⅱ-脱饱和酶的克隆、表达和功能鉴定
- 2015年
- 产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对其中的Δ6-Ⅱ脱饱和酶进行克隆、表达和功能鉴定。首先以p YES2/NT C质粒为骨架构建了Δ6-Ⅱ脱饱和酶基因(FADS6-Ⅱ)的表达载体(p YES2/NT C-FADS6-Ⅱ),并转化至酿酒酵母中进行诱导表达,进一步通过在重组菌培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察Δ6-Ⅱ脱饱和酶对各底物的偏好作用。实验结果表明,在分别添加0.5 mmol/L亚油酸(LA)和0.5 mmol/Lα-亚麻酸(ALA)时,Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为42.94%,对ALA没有催化作用。而当底物添加方式改为同时添加LA和ALA时(分别为0.25 mmol/L),Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为37.12%,对ALA仍没有催化作用。该实验结果为高山被孢霉中Δ6-Ⅱ脱饱和酶的催化功能研究提供了理论依据。
- 史海粟陈海琴顾震南张灏陈永泉陈卫
- 关键词：高山被孢霉
- 高山被孢霉中Δ9脂肪酸脱饱和酶的表达、纯化和其细胞色素b_5功能域的鉴定
- 2017年
- 在毕赤酵母中表达和纯化源自高山被孢霉ATCC 32222的膜结合Δ9-I脂肪酸脱饱和酶,测定其活性,并探究其细胞色素b_5功能域的性质。构建含有高效纯化标签ZZ-tag的表达载体;用Western blotting和SDS-PAGE筛选Δ9-I脂肪酸脱饱和酶高表达量转化子;通过梯度离心和去垢剂筛选确定膜蛋白质提取条件;采用IgG亲和纯化色谱和阴离子交换色谱对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶进行纯化;利用酿酒酵母细胞破碎物为底物考察Δ9-I脂肪酸脱饱和酶活性;通过波长扫描和Na_2S_2O_4还原实验对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶细胞色素b_5功能域进行表征。结果显示,目的蛋白质被成功表达并筛选出高表达量转化子;20 000g离心1h为最佳膜分离条件,Fos-Choline-16为最佳去垢剂;纯化后的Δ9-I脂肪酸脱饱和酶结构完整,具有细胞色素b_5功能域;在酿酒酵母提取物中Δ9-I脂肪酸脱饱和酶对C16:0和C18:0底物的转化效率分别为(16.88±9.32)%和(20.61±7.55)%;波长扫描显示Δ9-I脂肪酸脱饱和酶在411nm处有强吸收,并且在Na_2S_2O_4作用下被还原至422nm,说明细胞色素b_5功能域在体外能够被还原。因此,含有细胞色素b_5功能域的脂肪酸脱饱和酶的首次成功表达、纯化和鉴定为亚铁血红素脂肪酸脱饱和酶脱饱和反应机制的研究奠定了基础。
- 王明轩陈海琴顾震南陈卫陈永泉
- 关键词：脂肪酸脱饱和酶蛋白质纯化高山被孢霉
- 高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶I的克隆、表达和功能鉴定
- 2016年
- 【目的】鉴定产油微生物高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ的功能。【方法】将高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因与人可溶性细胞色素b_5还原酶基因序列比对,去除该基因N端穿膜区域后,与人可溶性细胞色素b_5基因分别在大肠杆菌中异源表达;通过钴离子亲和层析、离子交换和分子排阻色谱等方法对表达产物进行纯化;以2,6-二氯靛酚钠(DCIP)为底物,测定细胞色素b_5还原酶Ⅰ的体外活性及其对NADH和NADPH的偏好性;在反应体系中存在NADH时,通过全波长扫描方法检测细胞色素b_5还原酶Ⅰ与细胞色素b_5的相互作用。【结果】高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ被成功可溶表达,经纯化后检测到体外活性:使用NADH时酶活为564.57 U,使用NADPH时为51.97 U;在NADH存在时,细胞色素b_5还原酶Ⅰ能够还原细胞色素b_5,其吸收峰从411 nm偏移至422 nm,并在521 nm和554 nm处吸光值增加。【结论】细胞色素b_5还原酶Ⅰ N端穿膜区域的去除增加了其可溶性,并保持了蛋白质活性;高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因编码的是一种NADH-细胞色素b_5还原酶,其在体外能与细胞色素b_5相互作用。
- 王明轩陈海琴顾震南陈卫陈永泉
- 关键词：细胞色素B5高山被孢霉
- 肉毒碱脂酰转移酶基因沉默对高山被孢霉脂质积累的影响被引量：1
- 2016年
- 高山被孢霉是一种工业化生产多不饱和脂肪酸的产油真菌。通过分析高山被孢霉脂肪酸氧化途径中相关基因的转录水平,发现肉毒碱脂酰转移酶(carnitine acyl-transferase,CAT)基因与高山被孢霉脂肪酸氧化紧密相关,进一步利用RNA干扰技术实现在高山被孢霉中CAT基因的沉默,分析发现,在高山被孢霉重组菌中,CAT活性下调了33.3%,总脂肪酸积累量相比野生型菌株提高38.1%,表明通过抑制β氧化途径可以提高高山被孢霉的脂质积累量,这为推动高山被孢霉在脂质生物合成工业化方面的应用奠定了理论基础。
- 杨华陈海琴郝光飞顾震南陈卫陈永泉
- 关键词：高山被孢霉RNA干扰
- 一种新ω-3脂肪酸脱饱和酶的克隆表达和活性鉴定被引量：4
- 2016年
- ω-3脂肪酸脱饱和酶催化ω-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)转化为ω-3 PUFAs,对ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)的合成至关重要。为了实现在常温下发酵生产ω-3 LC-PUFAs(主要是二十碳五烯酸,EPA),根据现有常温下偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脱饱和酶序列,从Gen Bank数据库筛选出与之高度相似的序列并进行生物信息学分析。为了确定序列的生物活性,进一步在酿酒酵母系统中进行重组表达,通过外源添加不同碳链长度的脂肪酸底物,测定重组酿酒酵母转化子在28℃和12℃下对不同脂肪酸的转化率。结果显示,新筛选序列编码的蛋白oAiFADS17既能催化18C PUFAs,又能催化20C PUFAs,尤其偏好催化二十碳四烯酸(AA)转化为EPA。oAiFADS17蛋白在28℃下对各种底物的转化率均高于12℃下的转化率,其中对AA的转化率达到46.3%。该研究成功测定了oAiFADS17蛋白对不同脂肪酸底物的转化率,得到了一种新的常温偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脱饱和酶,为构建高产EPA的基因工程菌株及EPA的工业化生产奠定了理论基础。
- 梅甜甜陈海琴郝光飞顾震南陈卫陈永泉
- 高山被孢霉中Δ6脱饱和酶关键位点及其对活性的影响
- 2016年
- 高山被孢霉中Δ6脱饱和酶(Ma FADS6)是决定ω3/ω6多不饱和脂肪酸代谢流的关键酶。利用定点突变技术研究Ma FADS6-Ι一级结构与功能的关系,为高山被孢霉多不饱和脂肪酸的合成提供了理论依据。利用非链取代式质粒扩增技术对已构建质粒p YES2/NT C-Ma FADS6-Ι内的表达单元(即Ma FADS6-Ι)中细胞色素b5区(HPGG)下游的位点进行定点突变,将所有突变体分别转化酿酒酵母进行诱导表达,进一步通过在培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察重组菌对各底物的催化作用。实验结果表明,所有突变体催化α-亚麻酸(ALA)的活性没有改变;K61和D68两个位点对催化亚油酸(LA)起关键作用,其对应的4个突变体对LA的转化率分别为(6.2±0.5)%(K61T)、(0.3±0.0)%(K61F)、(8.2±0.7)%(D68N)和(6.6±0.8)%(D68L),相比原始转化率各降低50%以上;G63和T69两个位点对LA的催化无直接影响,但G63T突变体由于突变位点极性改变,其对LA的转化率为(8.5±0.9)%,比原始转化率降低了49.9%;而V66位点的突变体对LA的转化率分别为(22.3±2.6)%(V66T)和(20.7±2.5)%(V66A),比原始转化率分别降低了36.1%和37.8%。确定了Ma FADS6-Ι氨基酸序列中K61和D68两个关键氨基酸位点经突变后均会使其酶活明显降低,这为研究Ma FADS6-Ι一级结构与功能的关系提供了理论依据。
- 史海粟陈海琴顾震南张灏陈永泉陈卫
- 关键词：高山被孢霉定点突变
