山东省自然科学基金(Y2007C96)
- 作品数：3 被引量：6H指数：2
- 相关作者：陈蔚文张菊姜安丽关恒云胡晓燕更多>>
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- 相关领域：生物学更多>>
- miRNA let-7a1真核表达载体的构建及对肺癌细胞增殖的影响被引量：3
- 2009年
- 目的:构建miRNA let-7a1真核表达载体,研究其在肺癌A549细胞株的表达及对A549细胞增殖的影响。方法:以人肺癌细胞A549的总RNA为模板,RT-PCR扩增miRNApre-let-7a1基因序列,将miRNApre-let-7a1基因克隆到真核表达载体pSilencerTM4.1-CMVneo中,构建成pSilencerTM4.1-let-7a1重组体。将pSilencerTM4.1-let-7a1表达载体瞬时转染肺癌A549细胞,RT-PCR法检测miRNAlet-7a1在转录水平的表达。根据miRBaseTargets数据库,查hsa-let-7a1靶序列,构建let-7a1靶序列-报道基因融合质粒pMIR-report-let-7a1T,与pSilencerTM4.1-let-7a1表达载体共转染A549细胞,通过荧光素酶活性检测pSilencerTM4.1-let-7a1质粒对其靶序列的作用。MTT法检测pSilencerTM4.1-let-7a1转染A549细胞后,对细胞增殖的影响。结果:pSilencerTM4.1-let-7a1真核表达栽体和let-7a1靶序列-报道基因融合质粒经酶切及测序鉴定正确。pSilen-cerTM4.1-let-7a1转染A549细胞后,经RT-PCR证明能有效表达miRNAlet-7a1。pSilencerTM4.1-let-7a1质粒和pMIR-report-let-7a1T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测,相对荧光素酶活性明显降低,表明pSilencerTM4.1-let-7a1转染A549细胞后,可表达let-7a1并具有生物学活性。MTT检测结果显示:pSilencerTM4.1-let-7a1转染后的A549活细胞数目明显减少。结论:成功构建了真核表达载体pSilencerTM4.1-let-7a1,转染肺腺癌A549细胞后能有效表达,miRNAlet-7a1基因过表达抑制A549细胞的增殖。
- 张菊关恒云张鹏举陈蔚文刘闻闻赵健胡晓燕姜安丽
- 关键词：MIRNA真核表达载体A549细胞细胞增殖
- 人miRNA let-7a2质粒的构建及其表达被引量：2
- 2009年
- 目的构建人miRNA let-7a2真核表达质粒,检测其在肺癌细胞A549中的表达。方法以人肺腺癌A549细胞总RNA为模板,将RT-PCR扩增let-7a2的前体(pre-let7a2)序列,克隆至pSilencer4.1-CMVneo表达载体中,构建pSilencer4.1-let7a2重组质粒,转染A549细胞,采用RT-PCR法检测pre-let7a2的表达;构建let-7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR-Report-let7a2T,与pSilencer4.1-let7a2质粒共转染A549细胞,测定相对荧光素酶活性,以检测成熟let7a2在A549细胞中的表达及作用;采用MTT比色法检测pSilencer4.1-let7a2转染对A549细胞增殖的影响。结果构建的人let-7a2真核表达质粒pSilencer4.1-let7a2和let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR-Report-let7a2T经酶切及测序鉴定正确;pSilencer4.1-let7a2质粒转染A549细胞后,RT-PCR检测pre-let7a2表达较对照组明显增强;MTT比色法显示let-7a2对A549细胞增殖有抑制作用。pSilencer4.1-let7a2质粒和pMIR-Report-let7a2T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测相对荧光素酶活性较对照组降低,显示let-7a2表达质粒转染A549细胞后,可有效表达let-7a2并转变为成熟的具有生物学活性的let-7a2。结论成功构建了人let-7a2真核表达质粒,并在肺腺癌细胞A549中有效表达。
- 关恒云张菊张鹏举陈蔚文刘闻闻于春晓胡晓燕姜安丽
- 关键词：肺肿瘤基因表达调控MIRNA
- 人PCAN1基因启动子的克隆及其上游调控区域的鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的克隆人前列腺癌基因1(PCAN1)5′上游2.6 kb启动子片段,构建pGL3-p2.6 kb载体,测定其启动子活性,初步鉴定该片段内的DNA调控区域。方法采用PCR法从人基因组DNA中扩增PCAN1基因5′上游2.6 kb启动子片段,并构建到荧光素酶报道基因载体pGL3-basic中,构成pGL3-p2.6 kb;瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP,通过双荧光素酶活性检验测定PCAN1启动子活性。使用Erase-a-system对pGL3-p2.6kb载体中2.6 kb片段进行一系列5′侧翼缺失,产生12个缺失体,分别瞬时转染LNCaP细胞,通过检测荧光素酶的活性观察缺失突变对PCAN1启动子活性的影响。结果克隆的PCAN1 2.6 kb启动子片段经测序鉴定正确无误;pGL3-p2.6 kb转染LNCaP细胞后,双荧光素酶活性测定结果显示2.6 kb片段具有明显的启动子活性;5′缺失突变分析显示,PCAN1基因上游-1599 bp至-1541 bp、-347 bp至-84 bp的缺失,与2.6 kb片段相比,启动子活性分别升高2.24倍和2.53倍,-1541 bp至-1226 bp的缺失,与2.6 kb片段相比,启动子活性降低2.11倍。结论克隆的人PCAN1基因5′上游2.6 kb片段具有较强的启动子活性,PCAN1基因上游2.6 kb区域内分别存在2个负调控区和1个正调控区。
- 刘闻闻张菊关恒云张鹏举陈蔚文康鲁东胡晓燕吴伟芳姜安丽
- 关键词：基因缺失基因表达调控
