江苏省自然科学基金(BK2010039)
- 作品数：5 被引量：9H指数：2
- 相关作者：方强焦新安潘志明孙小林刘仲义更多>>
- 相关机构：扬州大学江苏大学更多>>
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- 甲型H1N1流感病毒HA基因与沙门菌fljB基因的融合表达与鉴定被引量：2
- 2012年
- 目的研发基于鞭毛蛋白的新型甲型H1N1流感疫苗。方法分别以鼠伤寒沙门菌SL7202基因组和含有甲型H1N1流感病毒HA基因的重组质粒pET-HA为模板,通过PCR扩增Ⅱ相鞭毛蛋白fljB和HA1-2基因,再通过overlapPCR将这两基因片段拼接成HA1-2-fljB,将其插入原核表达质粒pET30a(+),构建重组质粒pET-HA1-2-fljB,并转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白HA1-2-fljB的表达。结果正确构建出重组质粒pET-HA1-2-fljB,SDS-PAGE和Western blotting结果显示,融合蛋白分子量约84kD,并具有良好的免疫反应性,能强烈诱导HEK293-mTLR5细胞分泌IL-8。结论成功表达具有TLR5生物学活性的融合蛋白HA1-2-fljB,为研究甲型H1N1流感疫苗奠定了基础。
- 杨芸潘志明马全刚张磊康喜龙耿士忠焦新安
- 关键词：鞭毛蛋白血凝素原核表达
- 我国地方品种姜曲海猪TLR5基因的克隆、表达及鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的:克隆我国地方品种姜曲海猪TLR5基因,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性,为进一步研制TLR5单克隆抗体(mAb)提供免疫原。方法:从全血中提取姜曲海猪的基因组,设计特异性引物,利用PCR方法扩增得到TLR5基因片段,PCR产物克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达质粒pET-TLR5,将重组表达质粒转化E.coli BL21,0.5 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定蛋白活性。结果:成功扩增出猪TLR5基因片段,大小为2 571 bp。酶切鉴定结果表明,猪的TLR5基因成功克隆入原核表达载体pET30a(+)中,重组质粒pET-TLR5在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出相对分子质量(Mr)大小约95 200;Western blot结果表明,表达产物与兔抗小鼠TLR5 mAb具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达具有较好免疫原性的猪TLR5分子,为其mAb的制备提供生物材料。
- 孙小林潘志明方强刘仲义焦新安
- 关键词：克隆原核表达
- 麻鸭白细胞介素17的原核表达及鉴定被引量：1
- 2011年
- 为表达麻鸭白介素17(duIL-17),本研究提取ConA刺激的麻鸭脾脏淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增duIL-17基因片段,将该片段插入克隆载体pCR2.1中构建重组质粒pCR2.1-duIL17。将duIL-17基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-duIL17,将其转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达。测序结果显示,duIL-17与参考序列(EU366165.1)相比较第174位碱基由C突变为T,并且为沉默突变。SDS-PAGE和westernblot分析显示,诱导表达的重组蛋白GST-duIL17主要以包涵体形式存在,分子量大小约为45ku,duIL-17与抗鸡IL-17抗体具有良好反应性。本研究为制备duIL-17单克隆抗体提供了实验依据。
- 赵雯潘志明耿士忠康喜龙方强丛秋霞焦新安
- 关键词：麻鸭IL-17原核表达免疫反应性
- 展呈H5N1亚型禽流感病毒M2e表位鞭毛蛋白的构建及其免疫原性被引量：3
- 2012年
- 以重组质粒pET-fliC和pUC57-M2e2为模板,通过重叠PCR将M2e2基因插入fliC的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/M2e2。将fliC/M2e2片段插入原核表达载体pET30a+,获得重组质粒pET-fliC/M2e2,将其转化鼠伤寒沙门氏菌LB5000,获得重组菌LB5000(fliC/M2e2)。应用P22噬菌体转导技术,将fliC/M2e2基因导入都柏林沙门氏菌SL5928的基因组中,经生化血清学鉴定、动力学测定、透射电镜观察、Western-blot分析,将阳性转导菌命名为SL5928(fliC/M2e2)。提取重组菌鞭毛蛋白fliC/M2e2作用HEK293-mTLR5细胞,能刺激细胞分泌IL-8。将fliC/M2e2通过皮下注射途径免疫C3H/HeJ小鼠,50μg/只。结果显示,二免后第14天,fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫组的血清抗体效价与对照组之间呈现显著性差异(P<0.05)。ELISPOT结果表明,在脾细胞中,fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫组检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,且免疫应答以Th1型为主。结果表明,构建的fliC/M2e2嵌合基因能够在沙门氏菌中表达,重组嵌合鞭毛蛋白fliC/M2e2能激发机体针对M2e表位的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答。
- 游猛潘志明方强耿士忠康喜龙杨芸焦新安
- 关键词：鞭毛蛋白禽流感病毒免疫原性
- 人癌胚抗原相关细胞黏附分子1介导的小鼠淋病奈瑟菌易感性
- 2011年
- 目的研究制备淋病奈瑟菌感染人癌胚抗原相关细胞黏附分子1（hCEACAMl）转基因小鼠模型的可行性。方法用hCEACAMl真核表达载体pCDPGICEAl，通过显微注射法制备转基因小鼠，PCR及序列分析法检测目的基因在小鼠基因组中的整合，Westernblot及FACS技术检测目的基因的表达，镜检及培养法检查淋病奈瑟菌对转基因小鼠的感染。结果产生的22只F0代小鼠中4只为转基因整合阳性，其中1只可表达hCEACAMl蛋白，且目的蛋白表达在细胞膜上。淋病奈瑟菌可在转基因小鼠中形成感染。结论hCEACAMl转基因小鼠可作为淋病奈瑟菌感染研究的转基因动物模型。
- 李国才杜庆辉王晓红王劲松于峰刘双喜解如山焦红梅严华季明春
- 关键词：转基因小鼠淋病奈瑟菌易感性
