四川省科技支撑计划(2011FZ0065)
- 作品数：7 被引量：23H指数：3
- 相关作者：徐志文朱玲周远成郭万柱陈蕾更多>>
- 相关机构：四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室更多>>
- 发文基金：四川省科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪NF-κB p65/p50亚基的原核表达及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响被引量：3
- 2013年
- 为了研究经原核表达的猪细胞核转录因子NF-κB p65/p50融合蛋白对猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)体外增殖影响,本文采用RT-PCR技术扩增出编码成熟p50区和p65开放阅读框(ORF),将其克隆至pET21a(+)中,转化至Rosetta感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)对表达产物进行鉴定;纯化复性后添加到DMEM细胞维持液中,观察p65/p50对Marc145细胞毒性,确定最佳使用浓度;探讨最佳浓度的p65/p50对PRRSV体外感染增殖活力的影响,通过实时荧光定量PCR方法研究PRRSV感染时相,绘制PRRSV增殖曲线。成功构建了大量以包涵体形式表达Mr均约为70kD的p65/p50融合蛋白的p65/p50-pET21a(+)原核表达载体;Western-blot显示p50和p65重组蛋白可分别与兔抗人p50多克隆血清、兔抗人p65纯化抗体反应。确定p65/p50最佳添加浓度为0.4μg/mL。通过实时荧光定量PCR技术研究PRRSV感染时相,结果表明NF-κB p65/p50可促进PRRSV感染Marc-145CPE出现及病毒早期增殖;但CPE出现后,病毒增殖受到抑制,病毒滴度水平显著降低(P<0.05)。该结果为进一步研究PRRS的发病机理及治疗策略提供了新思路。
- 王潇娣朱玲蔡雨函黄仆徐志文
- 关键词：核转录因子-ΚB猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒复制
- 猪巨细胞病毒环介导等温扩增方法的建立被引量：4
- 2015年
- 根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的DNA序列设计合成4对特异性引物,通过优化反应条件,以及敏感性、特异性检测,建立了猪巨细胞病毒的环介导等温扩增检测方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP);用建立的检测方法对2013年来自四川省雅安、成都、绵阳、眉山、乐山、德阳、遂宁、资阳等市的136份病料进行猪巨细胞病毒检测,将检测结果与常规PCR方法检测结果进行比对。结果显示,本试验建立的方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,是常规PCR的10倍;136份病料用LAMP检测,其中有89份样品为猪巨细胞病毒阳性,其阳性率与常规PCR方法检测的阳性相符率为100%。结果表明,本试验成功建立了PCMV的LAMP检测方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊,对PCMV的快速诊断、综合防控等具有重要意义。
- 廖春燕徐志文周远成朱玲郭万柱
- 关键词：环介导等温扩增技术
- 猪嵴病毒RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：8
- 2013年
- 根据GenBank中猪嵴病毒(porcine kobuvirus)3D-RNA聚合酶基因序列设计并合成了1对特异性引物,建立了一种猪嵴病毒RT-PCR检测方法。反应产物测序结果与GenBank中猪嵴病毒SH-W-CHN/2010/China株比较,基因序列同源性为93%。利用该方法对猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、链球菌、猪巴氏杆菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验表明,该方法最低能检测到的病毒核酸含量为1pg。利用所建立的RT-PCR方法检测采集自我国四川地区123份临床样品,结果阳性率为59.3%,表明猪嵴病毒在四川地区猪群中流行率较高。
- 李淞朱玲周远成吴云飞陈蕾徐志文郭万柱
- 关键词：RT-PCR
- 猪细环病毒2型ORF1基因的原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：1
- 2013年
- 为制备猪细环病毒2型(TTSuV2)ORF1多克隆抗体,以TTSuV2阳性DNA为模板,经PCR扩增目的基因,并克隆于表达载体pET-32a(+),构建了ORF1基因的重组表达载体pET-TTSuV2-ORF1。重组质粒鉴定验证后,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示重组蛋白分子质量约为45.3ku,主要以可溶性蛋白的形式存在,Western-blot分析结果显示重组蛋白能够与TTSuV2阳性血清反应。表达的蛋白经HisTrapFF组氨酸标签融合蛋白纯化柱纯化后,免疫家兔,制备多克隆抗体,Western-blot分析结果显示制备的抗体具有高度的特异性,ELISA测定抗体效价为1∶1 600。证明,成功制备了特异的TTSuV2ORF1多克隆抗体。
- 李淞朱玲周远成陈蕾徐志文郭万柱
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 猪NF-kappaB p65/p50基因克隆、序列鉴定及实时荧光定量PCR检测方法的建立
- 2013年
- NF-κB信号通路在病毒感染、免疫损伤性疾病、肿瘤疾病中发挥重要作用,其活化水平常作为机体免疫应答水平、疾病发展进程的检测指标。为获得猪NF-κB p65/p50基因序列特征并建立体外定量检测其表达水平的实时荧光定量PCR方法,作者对猪NF-κB p65ORF和成熟p50编码区进行RT-PCR扩增、克隆、测序及生物信息学分析;设计特异性荧光定量引物,建立检测p65、p50实时荧光定量PCR方法。结果显示:所扩增的猪NF-κB p65ORF长1 662bp,编码553aa,成熟p50编码区长1 653bp,编码551aa;与不同动物的p65、p50序列相似性均较高;56.5%p65位于细胞核内,78.3%p50存在于细胞质中,p65、p50均无信号肽及跨膜区。荧光定量结果表明:起始模板与Ct值之间线性关系好,相关系数达到0.999,扩增效率均在95%左右;敏感性高,初始模板的检出下限达到101 copies.μL-1;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内变异系数均小于5‰。本试验为进一步研究猪NF-κB p65/p50生物学功能及其在猪相关疾病发生发展中表达量变化奠定了基础。
- 王潇娣朱玲廖春燕黄仆徐志文郭万柱
- 关键词：实时荧光定量RT-PCR
- 猪核转录因子C-Rel亚基的克隆及PRV体外感染PK-15细胞对C-Rel转录时相的影响被引量：3
- 2014年
- 核转录因子κB是普遍存在于真核细胞中的转录调节因子,其信号通路在细菌、病毒感染宿主致病过程中起关键作用,直接调控宿主先天性免疫反应及细胞增殖、分化和凋亡,它的异常活化可能是PRV感染导致免疫抑制的重要原因。为进一步了解NF-κB C-Rel亚基序列特征及PRV对C-Rel mRNA转录时相的影响,本试验采用RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增NF-κB C-Rel ORF,获得阳性质粒后测序,进行相关生物信息学分析;运用实时荧光定量PCR技术对PRV感染PK-15细胞后不同时期C-Rel mRNA的转录水平进行定量分析。序列分析结果表明:所扩增猪C-Rel亚基ORF长1 773bp,编码590aa;猪C-Rel核苷酸序列与不同动物的C-Rel核苷酸序列相似性较高;大部分位于细胞核内(76.0%),无信号肽及跨膜区。荧光定量结果表明:与对照组相比,感染后0~4h,C-Rel转录水平下调,2和4h差异显著(P<0.05);4~12h,快速上调,12h达到转录高峰(P<0.01);12h后逐渐下降,24~120h,维持在较低水平,其中36h差异极显著(P<0.01),48、72和120h差异显著(P<0.05)。本研究推断PRV感染早期较弱的先天性免疫应答可能与C-Rel活化水平低下有关。
- 付梦瑾朱玲周远成杨文宇李新琼徐志文
- 关键词：C-REL转录时相
- 猪传染性胃肠炎病毒四川株的分离鉴定与一步生长曲线的测定被引量：4
- 2012年
- 为研究猪传染性胃肠炎病毒的生长规律,利用PK-15细胞从四川仔猪腹泻样品中分离得到1株病毒,经PCR检测、病毒理化试验与微量中和试验证实,该分离株为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),被命名为SC-T。以SC-T分离株感染PK-15细胞,感染后不同时间分别收集感染细胞与上清,利用TGEV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析,绘制TGEV一步生长曲线。结果显示,感染后第2～8小时,细胞内病毒RNA含量迅速增长,第8～32小时细胞内病毒RNA含量变化不大,维持在较高水平。细胞外病毒RNA含量呈"S型"曲线增长,感染后第0～6小时为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;第6～28小时为突破期,病毒RNA含量呈对数增长;感染后第28～32小时增长速度减缓,维持在较高水平,逐步进入稳定期。结果表明,TGEV感染PK-15细胞,病毒在细胞内增殖到一定数量以后,便逐步向胞外释出。
- 代洪波陈蕾朱玲周远成郭万柱徐志文
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒荧光定量PCR
