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利用ChIP技术研究SAF基因编码区组蛋白修饰变化被引量：1: 2015年; 目的:探讨血清淀粉样蛋白A转录激活因子(serum amyloid A-activating transcription factor,SAF)编码区外显子e4A和e4B区域的组蛋白表观遗传学信息,为进一步研究SAF自身的转录调控机制和该基因转录与前体mRNA剪接的关系奠定基础。方法:利用染色体免疫共沉淀实验(Ch IP)分析SAF基因编码区组蛋白修饰的变化。首先收集LPS刺激不同时间的THP-1细胞,终浓度为1%甲醛交联蛋白质和DNA,利用超声波将其染色体随机断裂成适当大小的片段,选用Ch IP级别兔多克隆抗组蛋白H3抗体、兔多克隆抗组蛋白H3K36三甲基化抗体、兔多克隆抗组蛋白H3K9单甲基化抗体和兔多克隆抗RNA聚合酶II CTD重复区5号丝氨酸磷酸化抗体实验,以富集得到的DNA样品为模板进行半定量PCR和定量q PCR分析。结果:LPS刺激作用下SAF基因编码区组蛋白H3富集信号减弱、外显子e4A区域单个核小体上H3K9单甲基化(H3K9me1)水平减弱、H3K36三甲基化(H3K36me3)修饰富集水平增加、RNA pol II CTD重复序列第5号丝氨酸磷酸化水平降低。结论:LPS刺激导致SAF基因编码区组蛋白H3离散,该区域核小体解散、凝聚的染色体重塑呈开放构象;含SAF编码区基因信息的DNA暴露,利于RNA pol II转录延伸。; 曹锡梅罗旭光梁俊红张潮白丽娟郭大玮; 关键词：组蛋白修饰 THP-1细胞

转录因子MAZ对c1orf109基因转录表达调控的体外研究: 2018年; 目的:本文旨在研究转录因子Myc相关锌指蛋白(MAZ)在体外对人类1号染色体开放阅读框109(c1orf109)基因的转录表达调控。方法:体外条件下,采用凝胶电泳迁移实验筛选c1orf109基因启动子区MAZ的结合位点,并利用本室构建的由c1orf109启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白报告载体与MAZ和转录因子特化蛋白1(Sp1)的表达质粒共转染He La细胞,24 h后,用激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测c1orf109基因的转录表达情况。结果:c1orf109启动子区可与MAZ结合,且有与Sp1共享的结合位点;MAZ与Sp1皆可抑制c1orf109的转录表达,且Sp1的抑制作用大于MAZ(P<0.05)。结论:MAZ与Sp1两个转录因子共同调控c1orf109基因在生理及病理条件的表达,且调控方向一致。; 王雪伟任剑波王小怡王博高哲郭大玮; 关键词：转录因子

提高SAF基因启动子区DNA模板聚合酶链式反应的扩增效率: 2013年; 背景:血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区鸟嘌呤和胞嘧啶的含量偏高,常规聚合酶链式反应扩增不易成功。目的:探索提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区富含鸟嘌呤和胞嘧啶的DNA模板聚合酶链式反应扩增方案及优化的扩增体系。方法:提取THP-1细胞基因组DNA作为模板,通过97℃高温预变性及最佳退火温度的探索优化聚合酶链式反应的反应条件,在聚合酶链式反应扩增体系中添加不同浓度的增强剂二甲基亚砜改善反应体系。建立提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因富含鸟嘌呤和胞嘧啶的启动子区聚合酶链式反应扩增效率的方法,同时评估不同浓度二甲基亚砜对聚合酶链式反应扩增结果的影响。结果与结论:97℃高温预变性使模板DNA充分解链,同时提高退火温度至60℃,有利于提高聚合酶链式反应扩增产率;反应体系中添加2%二甲基亚砜可以提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区聚合酶链式反应产物的特异性和产率,但是鸟嘌呤和胞嘧啶含量不同对增强剂的依赖不一样。结果证实,高温预变性和较高的退火温度可以保证充分解链的模板DNA与引物特异性结合,但是DNA模板鸟嘌呤和胞嘧啶含量的不同对增强剂二甲基亚砜的依赖有差异。; 曹锡梅梁俊红张潮万东方蒙晓平郭大玮; 关键词：启动子鸟嘌呤胞嘧啶聚合酶链式反应

转录因子Elk-1调控MAZ基因启动子转录活性的体外研究被引量：2: 2017年; 该文旨在探究血清淀粉样蛋白A激活转录因子(serum amyloid A activating transcription factor,SAF),或称myc相关锌指蛋白(myc-associated zinc finger protein,MAZ)基因,除已证实的转录因子MAZ和Sp1(specificity protein 1)外,是否存在其他转录因子对MAZ基因启动子的转录激活具有调控作用。在生物信息学预测基础上,利用凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)筛查MAZ启动子区的转录因子结合位点。在EMSA筛查出MAZ启动子区包含转录激活因子ETS样蛋白1(ETS-like 1 transcription factor,Elk-1)结合位点后,通过该实验室构建的由MAZ启动子驱动的双荧光报告系统分析观察过表达转录因子Elk-1后MAZ启动子的转录激活情况。结果显示,转录因子Elk-1可结合MAZ启动子–525~–504 nt区的DNA序列;过表达Elk-1及Sp1均可使MAZ的两个转录子SAF-1和SAF-3转录水平降低且后一转录子被抑制尤甚。结果提示,Elk-1与Sp1共同参与调控MAZ基因两个转录子SAF-1和SAF-3的转录调控,在MAZ基因参与的细胞诸多生理疾病过程中,Elk-1可能通过该途径发挥其作用。; 王博贾琳娜王小怡张潮王雪伟任剑波高哲郭大玮; 关键词：转录因子

MSRE-qPCR法检测少弱精子症患者父源印记基因H19上游区域甲基化水平被引量：2: 2014年; 目的建立精子中父源印记基因H19上游区域MSRE-qPCR检测方法,并分析男性少弱精子症患者精子父源印记基因H19上游区域甲基化水平。方法收集20例正常精液样本,同时筛选30例少弱精子症患者精液样本,应用甲基化敏感性限制性内切酶法并结合定量PCR对所有样本父源印记基因H19上游区域甲基化水平进行分析。结果正常精液样本父源印记基因H19上游区域平均甲基化率为(99.8±2.72)%,高于少弱精子症患者精液样本的(82.4±15.30)%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 MSRE-qPCR法可用于父源印记基因H19上游区域甲基化水平的检测,少弱精子症者精液样本父源印记基因H19上游区域甲基化水平显著低于正常人。; 严鹏任丽娟成振郭大玮白丽娟贾琳娜; 关键词：少弱精子症 DNA甲基化

Chelex-100法提取DNA用于差异甲基化基因座检测的研究: 2014年; 目的通过对Chelex-100提取法提取的DNA用于酶切的研究,为差异甲基化在法医实际工作中的应用性研究提供一种快速提取酶切底物的方法。方法 HhaⅠ酶切基因组DNA,PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳检测,254 nm紫外灯下观察。结果 Chelex-100提取法提取的杂合子样本DNA加酶组只观察到来自父源的等位基因片段,而未加酶组能够观察到来自父源和母源的等位基因片段。结论 Chelex-100提取法提取的DNA能够作为酶切底物应用于差异甲基化基因座的研究。; 成振严鹏白丽娟贾琳娜郭大玮; 关键词：聚合酶链反应

均匀设计在候选内参基因RT-qPCR实验条件优化中的应用被引量：1: 2012年; 目的探讨均匀设计在候选内参基因RT-qPCR实验条件优化中的应用,有助于后期实验筛选不同状态下THP-1细胞的稳定内参基因。方法以THP-1细胞cDNA为模板,cDNA模板量、引物浓度和退火温度3个因素为影响因素,应用均匀设计3因素8水平,探索影响候选内参基因RT-qPCR的扩增条件,检测不同实验条件下的扩增效果,在最优扩增条件下建立候选内参基因定量扩增的相对标准曲线,并检测扩增效率。结果通过均匀设计,完成对cDNA模板量、引物浓度和退火温度3因素8水平的实验条件优化,建立候选内参基因RT-qPCR检测的最佳组合为cDNA模板量0.5μg、引物浓度200μmol/L、退火温度55℃。结论本实验选用均匀设计优化RT-qPCR实验条件,筛选出THP-1细胞候选内参基因RT-qPCR的最优实验条件。均匀设计适合于本实验研究多因素多水平试验条件的配比。; 曹锡梅梁俊红张潮万东方蒙晓平郭大玮; 关键词：均匀设计 RT-QPCR 内参基因 THP-1

LPS诱导下THP-1细胞基因表达内参基因的筛选: 2013年; 动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）是心脑血管疾病的主要病理基础，引起AS的病因很复杂。巨噬细胞在其发生、发展过程中有重要作用^[1,2]。抑制巨噬细胞的炎症反应有可能成为预防和治疗AS的一个重要的方向。已知人单核白血病（THP-1）细胞具有单核细胞和巨噬细胞的功能和生理学特性，被广泛用于毒理学、免疫学和动脉粥样硬化等研究领域^[3]。而G-细菌细胞膜的主要成分脂多糖（1ipop01ysaccharide，LPS）可以刺激单核巨噬细胞系统发生免疫反应^[4]。明确LPS刺激THP-1细胞的基因转录水平将有助于揭示AS的病因。; 梁俊红曹锡梅万东方张潮郭大玮; 关键词：实时定量PCR 内参基因脂多糖

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国家教育部博士点基金(20111417110003)

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