国家自然科学基金(30771809)
- 作品数：10 被引量：93H指数：4
- 相关作者：袁静黄留玉刘大伟何湘孙忠科更多>>
- 相关机构：军事医学科学院中国人民解放军江南大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 蛋白质磷酸化修饰的研究进展被引量：74
- 2009年
- 蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,它参与和调控生物体内的许多生命活动。通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化,调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。随着蛋白质组学技术的发展和应用,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。我们介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备、磷酸化蛋白的鉴定及磷酸化位点的预测、蛋白分离后磷酸化蛋白的检测,及蛋白质磷酸化的分子机制,并综述了近年来国内外的主要相关研究进展。
- 姜铮王芳何湘刘大伟陈宣男赵红庆黄留玉袁静
- 关键词：磷酸化修饰
- 长双歧杆菌NCC2705葡萄糖与果糖代谢的比较蛋白质组学被引量：3
- 2008年
- 为揭示长双歧杆菌NCC2705(Bifidobacterium longum NCC2705)果糖代谢途径,建立其果糖发酵模型。以本实验室前期构建的长双歧杆菌NCC2705菌株蛋白质参考图谱为基础,进行了果糖和葡萄糖生长的菌体比较蛋白质组学研究,利用MALDI-TOF和ESI-MS/MS鉴定差异蛋白,进一步通过半定量RT-PCR验证二者显著差异表达蛋白。果糖生长的菌体蛋白中鉴定到了所有葡萄糖降解途径中的酶和蛋白质,另外鉴定到3倍以上差异蛋白点9个,其对应的5个蛋白在果糖发酵中上调。半定量RT-PCR验证显著差异蛋白,显示在果糖发酵中具有高水平表达是ABC转运系统的果糖特异性-结合蛋白BL0033和ATP结合蛋白BL0034。果糖的发酵时间和浓度梯度试验显示诱导时间越长、浓度越高,BL0033的表达量越高。第一,比较蛋白谱证明果糖和葡萄糖以相同途径降解。第二,BL0033的表达是受果糖诱导的,果糖的吸收可能是通过一个特殊的转运系统,即ABC转运系统将果糖从胞外转运到胞内,其中BL0033和BL0034共同作为系统元件扮演了重要角色。
- 孙忠科卜歆何湘姜铮王芳赵红庆刘大伟袁静
- 关键词：比较蛋白质组半定量RT-PCR
- 长双歧杆菌NCC2705高效转化系统的建立及GFP表达被引量：5
- 2010年
- 目的:建立长双歧杆菌NCC2705高效稳定的电转化系统,并以其为宿主表达绿色荧光蛋白(GFP),构建一个稳定的带报告基因的表达载体。方法:从双歧杆菌克隆载体pDG7中切取其在双歧杆菌中复制所必需的pMB1复制子插入质粒pUC19的多克隆位点区,并将gfp基因在双歧杆菌中进行表达;设计双歧杆菌电击转化体系,研究在不同电击电压条件下的电转效率。结果:首先构建了大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭质粒pUB1和带有gfp基因的表达质粒pUB2,用电击法将之转化至双歧杆菌,当细菌生长到D600nm约为0.5时制备感受态细胞,在电容25μF、电阻200Ω、电压12.5 kV/cm的电击条件下进行完整质粒转化,可得到较高的转化率。结论:构建了以长双歧杆菌NCC2705为宿主的高效稳定的表达系统,为进一步研究益生菌的分子生物学和功能特性提供了基础。
- 刘大伟孙忠科郭燕红黄留玉袁静
- 关键词：长双歧杆菌NCC2705质粒构建电转化绿色荧光蛋白
- 肝硬化小鼠肠道菌群结构及血清炎性因子的变化被引量：4
- 2014年
- 目的:观察肝硬化小鼠肠道菌群结构及血清炎性因子水平的变化。方法:通过CCl4灌胃构建小鼠的肝硬化模型;采用酶联免疫吸附法检测肝硬化进程中血清内毒素及炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α水平的变化;采集肝硬化小鼠新鲜粪便,通过荧光定量PCR实验检测肠道目的菌群的改变。结果:肝硬化小鼠肠道中拟杆菌属和梭菌属细菌显著减少,韦荣球菌属、肠杆菌属和肠球菌属细菌显著增加;随着肝硬化进程的加重,小鼠血液中内毒素及炎性因子水平显著提高。结论:肝硬化导致小鼠肠道菌群失调,促进了血液中内毒素及炎性因子水平的提高,形成恶性循环。
- 魏晓杨展崔茜邹大阳闫夏贝王思淼黄留玉袁静
- 关键词：菌群结构肝硬化小鼠肠道血清酶联免疫吸附法荧光定量PCR
- 长双歧杆菌NCC2705葡萄糖与乳糖代谢的比较蛋白质组学被引量：4
- 2008年
- 【目的】以本实验室前期构建的长双歧杆菌NCC2705菌株蛋白质参考图谱为基础,研究长双歧杆菌发酵乳糖和葡萄糖的比较蛋白质组学。【方法】采用ImageMaster 2D Elite Platnum Version5.0比较分析3倍以上蛋白差异点;利用MALDI-TOF进行差异蛋白鉴定,每个蛋白质点的肽指纹图谱在长双歧杆菌NCC2705菌株的蛋白质数据库用Mascot进行检索;采用Pro-Q磷酸化试剂进行磷酸化蛋白的染色。【结果】鉴定到31个蛋白表达发生显著变化,在乳糖发酵中14个蛋白上调17个蛋白下调。这些蛋白为亲水性酸性蛋白,它们基因的CAI值均在0.5以上,主要包括糖代谢相关蛋白、应激蛋白、转录和翻译相关蛋白,还有一些未知功能的蛋白。此外,有两个蛋白:转醛缩酶(BL0715,transaldolase,tal)L3蛋白点和丙酮酸激酶(BL0988,pyruvate kinase,pyk)G9蛋白点发生了磷酸化作用。【结论】长双歧杆菌NCC2705在乳糖中生长快于葡萄糖,它们的降解途径是相同的;转醛缩酶和丙酮酸激酶发生了翻译后修饰作用,推测转醛缩酶在43T和47S发生了磷酸化,而丙酮酸激酶在65S发生了磷酸化。
- 何湘刘大伟孙忠科王芳姜铮赵红庆陈宣男黄留玉袁静
- 关键词：比较蛋白质组双向电泳磷酸化蛋白
- DNA稳定同位素探针技术在宏基因组学中的应用及前景被引量：2
- 2011年
- DNA稳定同位素探针(DNA-SIP)是一种新兴的技术,通过将同位素稳定结合到特定的底物来确定环境中微生物的作用。DNA-SIP与宏基因组学结合可以让某些微生物的特性与其特殊新陈代谢联系在一起,不仅可以从宏基因组库里检测到低含量的微生物,而且加速了对新的酶类和其他生物活性物质的发现。以下总结了SIP-宏基因组学技术的原理、应用及研究进展,并讨论了其在环境微生物学和生物技术的应用前景。
- 刘威魏晓袁静黄留玉
- 关键词：宏基因组学微生态
- 基于PCR的长片段DNA精确合成及应用被引量：1
- 2011年
- 长片段DNA的组装及基于PCR的长片段DNA的精确合成(PAS)是基因异源表达时简单快速合成长片段DNA的方法,适于合成含有较高GC含量、重复序列和复杂二级结构的长片段DNA分子(5～6 kb)。简要综述了PAS技术用于长片段DNA序列精确合成的基本原理、操作步骤、常见问题和解决方法,以及该技术的应用。
- 魏晓刘威黄留玉袁静
- 长双歧杆菌NCC2705 ATP结合蛋白BL0034表达与活性检测被引量：1
- 2010年
- 目的克隆长双歧杆菌NCC2705中ATP结合蛋白BL0034的基因,利用大肠杆菌表达并纯化GST-BL0034融合蛋白,测定其结合ATP的活性。方法以长双歧杆菌NCC2705基因组为模板PCR扩增BL0034基因,双酶切后连接到pGEX-4T-1表达载体上,转入大肠杆菌BL21中表达;用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂对可溶性的GST-BL0034融合蛋白进行纯化,并用Western印迹验证。结果将BL0034基因克隆至质粒pGEX-4T-1,构建表达载体pGEX-4T-1-BL0034。BL0034经0.05 mmoL/L IPTG诱导,16℃过夜表达,SDS-PAGE可见相对分子质量约为82×103的可溶性表达条带;亲和纯化GST-BL0034,Western印迹结果为阳性。对纯化后的融合BL0033蛋白结合ATP的能力进行了定量测定,每毫克BL0034蛋白能结合约40 nmol/L ATP。结论成功克隆了BL0034蛋白的基因,表达并纯化GST-BL0034蛋白,证实了BL0034与ATP具有较强的结合能力,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705 BL0034蛋白的功能奠定了基础,为阐明其在果糖ABC转运系统中如何通过水解ATP产生能量提供了前提。
- 刘大伟郭燕红孙忠科黄留玉袁静
- 关键词：长双歧杆菌NCC2705表达纯化ATP结合
- 长双歧杆菌BL0033与BL0034的相互作用研究
- 2010年
- 目的克隆表达B.longum NCC2705果糖ABC转运系统中BL0033、BL0034及其截短突变体,验证两蛋白的体外相互作用,并确定介导彼此相互作用的功能区域。方法将bl0033与bl0034基因克隆至载体pGEX-4T-1和pET32a并在E.coli中表达,采用谷胱甘肽-Sepharose 4B和镍柱分别对GST和His融合的蛋白进行纯化,GST pull-down验证BL0033与BL0034蛋白之间的相互作用。为了进一步确定BL0033和BL0034的作用位点,根据BL0033和BL0034基序特征构建截短突变体,GST pull-down实验检测截短体与完整蛋白结合的能力,确定介导相互作用的区域。结果在大肠杆菌中实现了融合蛋白的可溶性表达,经亲和层析获得了融合蛋白。GST pull-down实验证实BL0033与BL0034存在相互作用,其中BL0033的截短体1～23 aa能与BL0034结合,而截短体36～314 aa丧失了与BL0034的结合能力;BL0034的3个截短体中BL0034/8～244 aa、BL0034/33～220 aa能与BL0033相互作用,而BL0034/289～481 aa与BL0033没有作用。结论证实了BL0033与BL0034之间的相互作用,并确定BL0033的1～23 aa基序与BL0034的33～220 aa基序是这种相互作用的结构域,为进一步研究B.longum NCC2705果糖ABC转运系统的分子机制奠定了理论基础。
- 郭燕红刘大伟孙忠科邵长林何湘王雪松姜铮赵江丽刘威魏晓廖祥儒袁静
- 关键词：GST蛋白间相互作用
- 长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
- 2009年
- 目的:克隆长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033的基因,利用大肠杆菌表达GST-BL0033融合蛋白并纯化。方法:以长双歧杆菌NCC2705株基因组为模板,PCR扩增BL0033基因,并将其插入pGEX-4T-1表达载体,转化至大肠杆菌DH5α;提取质粒,经PCR、质粒双酶切及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21,并对表达条件进行摸索;用谷胱甘肽-Sepharose4B树脂对可溶性GST-BL0033融合蛋白进行纯化。结果:PCR扩增的BL0033基因长度接近1000bp,与预期值一致;重组菌在IPTG浓度为0.05mmoL/L的条件下,于16℃诱导过夜后,SDS-PAGE分析可见可溶性表达条带,相对分子质量约60×103,与预期值一致;亲和纯化后,SDS-PAGE结果显示单一的表达条带。结论:克隆了BL0033蛋白的基因,并表达纯化了融合蛋白GST-BL0033,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705株BL0033蛋白功能奠定了基础。
- 郭燕红刘大伟何湘陈宣男黄留玉廖祥儒袁静
- 关键词：长双歧杆菌基因克隆
