广东省自然科学基金(5009437)
- 作品数：7 被引量：3H指数：2
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- 相关机构：深圳市第二人民医院中山大学附属第二医院南方医科大学更多>>
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- RNA干扰应用于抑制脊髓损伤急性期白细胞介素6受体表达的实验(英文)
- 2007年
- 背景:由于中枢神经损伤后局部微环境病理生理机制极其复杂,尤其急性期炎性反应及继发胶质瘢痕形成对有效轴突再生、局部神经细胞再生排列及局部干细胞增殖迁徙影响极大,成为早期阻碍神经修复的根本原因,故如何有效拮抗损伤区急性期炎性损伤因素,优化神经再生微环境是目前脊髓损伤修复的重要策略之一。目的:应用大鼠脊髓损伤模型,设计构建并筛选最佳白细胞介素6受体α表达抑制shRNA腺病毒表达载体。设计:重复测量实验。单位:深圳市第二人民医院脊柱外科。材料:选用健康Wistar大鼠40只,雌雄不拘,鼠龄8～10周。兔抗鼠GFAP一抗购自Santa Cruz公司,siRNA构建真核表达质粒pGenesil(携带绿色荧光表达系统)购自武汉晶赛生物工程技术公司。方法:实验于2006-11在武汉同济医学院基础医学部免疫教研室开放实验室及深圳市第二人民医院医学实验中心完成。针对白细胞介素6受体α基因编码序列设计并合成三对9bp茎环结构19bp干扰序列特异性shRNA模板,体外构建带绿色荧光蛋白的重组腺病毒表达载体;并建立大鼠急性脊髓损伤模型,损伤后12h局部注射编码shRNA重组腺病毒,通过实时荧光定量RT-PCR及Western blot技术,观察RNA干扰后损伤脊髓局部白细胞介素6R表达抑制效果,筛选最佳抑制白细胞介素6R表达的腺病毒表达载体。主要观察指标:RNA干扰后损伤脊髓局部IL-6RRNA表达、蛋白表达水平抑制效果。结果:序列测定证实白细胞介素6R-shRNA重组腺病毒表达载体构建成功,通过实时荧光定量RT-PCR,Western blot技术筛选出最佳白细胞介素6R-shRNA效应腺病毒表达载体,在mRNA及蛋白表达水平抑制白细胞介素6R基因表达效率分别为49%和56%。结论:构建并筛选成功的白细胞介素6R-shRNA效应腺病毒表达载体,在大鼠急性脊髓损伤模型中能高效抑制白细胞介素6R基因表达。
- 高明勇肖建德李振宇闫洪印余铮田长庆陈扬顾洪生
- 关键词：脊髓损伤RNA干扰腺病毒
- 神经营养因子基因修饰的神经干细胞在脊髓损伤修复中的应用
- 2007年
- 中枢神经系统损伤后的再生修复一直是神经科学领域的前沿研究课题。其中脊髓损（spinal cord injury，SCI）无论是在发生率、还是在给患者造成的痛苦和社会负担方面来说，都使其成为该领域的研究重点。但是长期以来SCI缺乏有效治疗手段，因此探索SCI后的再生修复，使截瘫患者站起来，成为骨科和神经科医生最关注的问题之一。
- 郁时兵肖建德刘尚礼
- 关键词：脊髓损伤修复神经营养因子神经干细胞基因修饰中枢神经系统损伤再生修复
- 胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化(英文)被引量：2
- 2007年
- 背景:胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1同属于转化生长因子β超家族,两者在哺乳动物中枢与外周神经系统发育、分化及细胞周期的调节中扮演重要角色。目的:观察胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导脊髓源性神经干细胞的分化,并与单一因子诱导培养液比较。设计:对照观察。单位:南方医科大学附属深圳医院中心实验室。材料:选用10只清洁级孕16d的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。主要试剂及材料:DMEM/F12,B27(GIBCO);碱性成纤维细胞生长因子,EGF,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子-β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白(nestin)多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗,神经丝蛋白(NF-200)单抗(Sigma)。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。无菌条件下分离大鼠胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。实验分①基础培养基组:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02 B27添加液的DMEM/F12。原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆。②对照组:在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清。③碱性成纤维细胞生长因子组。④转化生长因子β1组。⑤胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组。换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子+2μg/L转化生长因子β1。①光镜观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化情况。②免疫细胞化学染色标记检测神经元与星状胶质细胞的表达。③通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。主要观察指标:①各组细胞分化�
- 高明勇肖建德李振宇闫洪印白润涛韩漫夫
- 关键词：胶质细胞源性神经营养因子转化生长因子Β1
- 人GDNF基因的腺病毒载体构建及其在人神经干细胞中的表达
- 2007年
- 目的:观察构建的含人胶质细胞源性生长因子(GDNF)基因腺病毒载体对人神经干细胞的感染及其基因表达情况,为脊髓损伤的基因及神经干细胞治疗提供前期实验依据。方法:从12周龄流产人新鲜胚胎中提取人神经干细胞并进行培养,行Nestin免疫荧光染色进行检验。将全长558bp编码人GDNF的cDNA克隆到重组腺病毒载体质粒,并在人胚肾细胞(HEK293细胞)中包装出含有目的基因hGDNF的腺病毒,然后用该腺病毒感染人神经干细胞,应用荧光显微镜和Western-blot检测病毒感染及外源基因的表达情况,并进行GFAP和Tubulin免疫荧光染色检测神经干细胞向神经细胞分化情况。结果:Nestin免疫荧光染色显示所培养细胞为阳性染色红色,表明其具有神经干细胞性状;感染48h后观察到神经干细胞中有大量的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达,以及hGDNF蛋白高表达;感染后的神经干细胞有长的伪足伸出,呈GFAP和Tubulin染色阳性,表明促进了神经干细胞向神经元的分化。结论:腺病毒对神经干细胞具有较高感染效率,可作为一种良好的基因导入载体,实现外源基因hGDNF在神经干细胞内的有效表达,并可为神经干细胞分化为神经元提供更有利条件。
- 郁时兵肖建德刘尚礼
- 关键词：胶质细胞源性神经营养因子神经干细胞基因腺病毒
- 胶质细胞源性神经营养因子和肿瘤坏死因子可溶性受体基因修饰的神经干细胞联合移植治疗脊髓损伤的实验研究被引量：2
- 2007年
- 目的探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和肿瘤坏死因子可溶性受体（sTNFR）腺病毒感染的人神经干细胞移植治疗脊髓损伤模型的可行性。方法先包装和扩增含GDNF和sTNFR基因的重组腺病毒，然后用该腺病毒感染人神经干细胞，再将这些神经干细胞移植到脊髓损伤局部。实验动物与分组：雄性sD大鼠，A组：hGDNF和sTNFR转基因神经干细胞移植组；B组：空病毒转基因神经干细胞移植组；c组：神经干细胞移植组；D组：只横断脊髓，不作移植；E组：对照组，只咬除棘突和椎板，不横断脊髓，不做其他处理；F组：不作任何处理。免疫组化检测外源基因的局部表达，最后进行组织学检查和BBB功能评分。结果免疫组化显示局部有外源基因表达，A组BBB功能评分优于C组，但组织学结果未见明显优势；这两组BBB评分显著优于阴性对照组，组织形态也有明显改善。结论腺病毒介导的GDNF和sTNFR基因修饰的神经干细胞移植是一种较好的脊髓损伤治疗方法。
- 郁时兵肖建德刘尚礼
- 关键词：胶质细胞源性神经营养因子肿瘤坏死因子神经干细胞脊髓损伤
- 胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1联合诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化特点
- 2007年
- 目的:观察胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1体外联合诱导对脊髓源性神经干细胞分化的影响,为了解神经干细胞在体内多因素环境下的分化表现提供实验依据。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。①碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白多抗,神经丝蛋白单抗(Sigma)。②选用清洁级孕16d的SD大鼠10只,无菌条件下取出胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。基础培养基组成:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02B27添加液的DMEM/F12。③原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆,在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清作为对照。同时设立碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1组、胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组,换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子+2μg/L转化生长因子β1。观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化行为,免疫细胞化学染色标记神经元与星状胶质细胞的表达。④通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化的形态学观察:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出3种神经细胞类型:神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②神经干细胞免疫组织化学检测:血清对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白�
- 李振宇高明勇闫洪印白润涛韩漫夫余铮
- 关键词：神经生长因子类转化生长因子Β
- 胚胎源脊髓组织诱导骨髓间质干细胞向神经元样细胞的分化(英文)
- 2007年
- 背景:研究发现骨髓间质干细胞在体外专门的诱导体系中能产生类似神经元烯醇化酶克隆球样神经球结构,故骨髓间质干细胞成为中枢神经损伤修复种子细胞的热门候选。目的:观察体外分化体系诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的情况。设计:观察性实验。单位:深圳市第二人民医院脊柱外科。材料:选用孕16d及2月龄的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。神经元烯醇化酶单抗、胶质纤维酸性蛋白多抗、神经中丝蛋白单抗均购自武汉博士德公司。方法:实验于2006-09在华中科技大学同济医学院基础医学部免疫室开放实验室及本院中心实验室完成。取大鼠下肢骨,离心分离鼠骨髓间质干细胞。提取孕16d大鼠胚胎脊髓组织匀浆,制备诱导液,诱导骨髓间质干细胞的分化。另取胚胎肌组织同法制备肌组织匀浆作对照。主要观察指标:对诱导后骨髓间质干细胞进行形态学观察及用抗神经元烯醇化酶、NF200、抗胶质纤维酸性蛋白分别标记神经元,星形胶质细胞。反应阳性诱导细胞免疫组化染色后光镜下随机数取10个非重叠视野进行观察,计算神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性细胞占总细胞数的比例。结果:①大鼠骨髓间质干细胞在诱导后细胞形态变化:诱导早期光镜下即见部分细胞胞体回缩,突起变长,变细;逐渐出现分化细胞突起生长,并相互交织,类似神经细胞,有的分支类似树突状分枝,对照组细胞形态变化不大。②诱导1周后,骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化相关抗原表达情况:脊髓匀浆组多数细胞表现为神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性;少数细胞表达胶质纤维酸性蛋白,对照组无神经细胞抗体阳性染色出现。而对照组未见神经细胞抗原反应阳性。免疫组化发现分化细胞神经元烯醇化酶、神经中丝蛋白表达阳性率分别为(68±1.7)%,(76.2±2.9)%
- 高明勇李振宇肖建德闫洪印
- 关键词：骨髓间质干细胞神经元脊髓匀浆
