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国家高技术研究发展计划(2006AA10Z305)
国家高技术研究发展计划(2006AA10Z305)
- 作品数：16 被引量：63H指数：6
- 相关作者：王武杨海麟张玲孙艳邬敏辰更多>>
- 相关机构：江南大学无锡市广播电视大学新乡医学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划工业生物技术教育部重点实验室基金更多>>
- 相关领域：生物学化学工程轻工技术与工程更多>>
- 胆固醇氧化酶分离纯化及应用的研究进展被引量：6
- 2009年
- 综述了不同微生物所产胆固醇氧化酶的分离纯化方法及应用研究情况,重点介绍了破除乳化体系的方法,血清中胆固醇含量的检测,并针对分离纯化与应用中存在的问题提出了今后的研究方向。
- 钟学敏孙艳张玲杨海麟王武
- 关键词：胆固醇氧化酶分离纯化乳化体系
- 重组E.coli胆固醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质研究被引量：2
- 2009年
- 对重组E.coli产生的胆固醇氧化酶采用70%硫酸铵盐析、CM Sepharose FF离子层析、Phenyl Sepharose 6 Fast疏水层析、Sephadex G-75凝胶过滤,得到的胆固醇氧化酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带,酶的纯化倍数为93,收率为21%。部分酶学性质表明:酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH7.5,热稳定范围在40℃以下,酶的pH稳定范围为6～9,分子量分别为50 kD和52 kD。酶动力学参数Km值及Vmax分别为8.2×10-5mol/L和0.21 mmol/(L.min)。
- 钟学敏张玲孙艳杨海麟王武
- 关键词：胆固醇氧化酶分离纯化酶学性质
- 建立高通量筛选耐热胆固醇氧化酶的方法被引量：2
- 2011年
- 建立了一种以滤膜为基础的高通量筛选耐高温胆固醇氧化酶产生菌的方法。利用酶偶联及胆固醇不溶于水的特性产生显色透明圈。酶的热处理过程和酶与底物的反应过程分开,有效地防止酶在热处理前与底物反应。高温处理是在滤膜上进行,从而克服了高温琼脂平板变软或熔化的缺点。用该方法筛选时,产生的红褐色透明圈较明显,易于挑出性能改善的突变菌株。转印所用NC膜的价格便宜,操作比较简便。
- 孙艳杨海麟王武
- 关键词：胆固醇氧化酶高通量筛选定向进化
- 重组大肠杆菌产胆固醇氧化酶的指数流加策略被引量：3
- 2010年
- 以指数流加策略高密度培养重组大肠杆菌,发酵生产胆固醇氧化酶。通过对比生长速率的分阶段控制使得细胞干重达40.128g/L。确定了最佳的诱导时机为菌体对数生长期的中期,产酶速率为1287.31U/(L·h)。菌体产酶水平达6436.56U/L,生产强度为459.75U/(L·h),实现了胆固醇氧化酶的高效生产。
- 孙艳王长城张玲杨海麟王武
- 关键词：胆固醇氧化酶
- 木聚糖酶XynⅡ的D37N突变、表达及酶学性质变化被引量：11
- 2008年
- 对来源于宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）E001的木聚糖酶XynⅡ进行同源建模和序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存在一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关,据此设计了XynⅡ的D37N定点突变。酵母表达的XynⅡD37N经纯化后与原酶XynⅡ（同样经毕赤酵母表达后纯化）进行酶学性质比较,结果表明,XynⅡD37N的最适pH由4.2升高到5.3,pH稳定范围由3.0-7.5缩减为3.0-5.5,但最适温度和热稳定性基本保持不变。结果证实,木聚糖酶XynⅡ的第37位Asp与最适pH相关,为进一步的结构与功能研究提供了理论基础。
- 周晨妍李东峰邬敏辰王武
- 关键词：宇佐美曲霉突变木聚糖酶
- 高密度培养重组大肠杆菌发酵生产胆固醇氧化酶的策略
- 2009年
- 以重组大肠杆菌发酵生产胆固醇氧化酶,依据溶解氧的变化控制底物的流加速率,实现了重组大肠杆菌的高密度培养,最高密度达85(OD600)。在此基础上确定了最佳的诱导时机为发酵中期,菌体产酶水平达.583(1.6U/L,产酶速率为971.77 U·L-1·h-1,生产强度为388.71U·L-1·h-1,实现了胆固醇氧化酶的高效生产。
- 王长城孙艳张玲王武杨海麟
- 关键词：胆固醇氧化酶分批补料
- 宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达被引量：6
- 2008年
- 将宇佐美曲霉E001的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPXY-NII,将其经SalⅠ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和KM71,xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXGL98(Mut+)和PXKL29(Muts)。该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXGL98与PXKL29培养物上清液中的酶活力分别可达1156.92 U/mL和1646.03 U/mL。
- 周晨妍邬敏辰李东峰王瑾王武
- 关键词：宇佐美曲霉毕赤酵母分泌表达
- 甾短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的表达被引量：13
- 2008年
- 为了实现胆固醇氧化酶在大肠杆菌中的表达,将甾短杆菌Brevibacteriumsp.DGCDC-82胆固醇氧化酶基因用PCR的方法去掉信号肽序列,连接到质粒pTrc99a,通过筛选得到了表达胆固醇氧化酶的重组菌JM109/pTrc99a-COD。经IPTG诱导后表达出相对分子质量约为5.5×104的蛋白质。分别考察了诱导温度、时间、IPTG浓度等因素对重组菌表达的胆固醇氧化酶的影响。在优化条件下,该胆固醇氧化酶的酶活可以达到700 U/L。酶学特性分析表明其反应的最适pH为7.5,最适温度为40℃。
- 张玲霍惠芝沈微杨海麟邬敏辰王武
- 关键词：BREVIBACTERIUM胆固醇氧化酶原核表达信号肽
- 高密度培养重组E-coli产胆固醇氧化酶的乳糖诱导策略被引量：2
- 2011年
- 研究了乳糖诱导重组大肠杆菌表达胆固醇氧化酶。结果表明,乳糖不仅可以作为诱导剂诱导外源蛋白的合成,而且能作为碳源促进菌体的生长。通过对诱导条件的优化,实现了重组大肠杆菌的高密度培养,最高密度达68.9(OD600);在此基础上确定了最佳的诱导时机为发酵中期,菌体产酶水平达6005.66U/L,生产强度为200.19U/L.h,实现了胆固醇氧化酶的高效生产。
- 杨海麟王长城张玲辛瑜孙艳王武
- 关键词：胆固醇氧化酶乳糖
- 猪心肌苹果酸脱氢酶的制备及应用被引量：4
- 2008年
- 设计并优化了从猪心中提取高纯度苹果酸脱氢酶的技术路线,采用组织破碎、二度硫酸铵盐析、DEAE Sepharose F.F.离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 F.F.疏水层析及Sephadex G-75Fine凝胶过滤等方法进行分离纯化,苹果酸脱氢酶比酶活达1 212.97 U/mg,纯化倍数达122.64倍,酶活力收率为53.64%。Sephadex G-75 Fine凝胶过滤和SDS-PAGE电泳结果显示纯化的苹果酸脱氢酶相对分子质量约为69 000,含有2个亚基,每个亚基的相对分子质量约为34 000。以制备的苹果酸脱氢酶和谷草转氨酶配成双酶反应体系,对葡萄酒中L-苹果酸的含量进行了测定;通过标准样品和葡萄酒样品精密度及回收率（93.2%～104%）实验。
- 龚韧孙艳王静霍惠芝杨海麟王武
- 关键词：苹果酸脱氢酶柱层析纯化
