天津市高等学校科技发展基金计划项目(20070903)
- 作品数：5 被引量：14H指数：3
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- 甜菜碱对枯草芽孢杆菌合成利巴韦林的影响被引量：2
- 2009年
- 以枯草芽孢杆菌TM903为供试菌株,采用摇瓶分批补料发酵的培养方式,考察了甜菜碱添加量对枯草芽孢杆菌合成利巴韦林及其合成途径中嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)活力的影响.结果表明,初始培养基添加0.7.g/L的甜菜碱,发酵36 h后每间隔3 h流加0.1 g/L甜菜碱,可显著提高PNPase的相对酶活,并且使利巴韦林的产量达4.21.g/L,比未添加前提高了47.2%.
- 邢晨光赵希景谢希贤陈宁
- 关键词：利巴韦林嘌呤核苷磷酸化酶枯草芽胞杆菌甜菜碱
- 枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶的纯化及酶学性质研究被引量：3
- 2008年
- 目的:对枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化及酶学性质研究。方法:经加热、硫酸铵盐析和SephadexG-100凝胶过滤,对枯草芽孢杆菌TM903中的嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果:酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7.5,在30～50℃时热稳定性较好;K+对该酶有激活作用,而Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对该酶有抑制作用;Km值为2.11mmol/L,Vmax值为0.84mmol/(min·L)。结论:分离纯化了枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶,并研究了其酶学性质,为利巴韦林的发酵工艺优化提供了重要的酶学理论基础。
- 刘淑云赵希景谢希贤徐庆阳陈宁
- 关键词：枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶分离纯化酶学性质
- 合成利巴韦林的关键酶嘌呤核苷磷酸化酶的原核表达及活性分析
- 2009年
- 目的:在枯草芽孢杆菌中表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)并分析其活性。方法:将PNPase的编码基因deoD克隆入pDG148表达载体,构建原核穿梭型表达载体pDG148-deoD,采用电转化方法将表达载体转入枯草芽孢杆菌WB600后诱导表达重组PNPase;研究重组PNPase的活性。结果与结论:获得的重组PNPase活性较对照提高了193.9%,其最适催化条件为65℃、pH7.5、500μmol/L底物浓度和1%1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺;对重组菌的发酵条件进行了初步优化,IPTG诱导6h后在发酵液中添加0.5%的Tween-80能大幅度提高重组PNPase的酶活力。
- 邢晨光吴飞王光路谢希贤徐庆阳陈宁
- 关键词：嘌呤核苷磷酸化酶原核表达活性分析利巴韦林
- 枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶酶学性质研究及在利巴韦林酶法合成中的应用被引量：5
- 2010年
- 利用PCR技术从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶的两种基因deoD和punA,构建工程菌并采用金属螯合层析纯化PNP702和PNP816,酶学性质研究表明：二者具有一致的最适反应温度（60℃）和最适反应pH值（7~8）,PNP816磷酸解肌苷的催化效率（kcat/Km）比PNP702高出11.12倍。底物特异性试验表明：PNP702为高分子量的六聚体,而PNP816为低分子量的三聚体。分别以纯化酶和工程菌菌体为酶源,以肌苷或鸟苷为核糖基供体,TCA（1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺）为底物,酶法合成核苷类抗病毒药物利巴韦林,PNP816和工程菌XL-B lue（pPNP816）较PNP702和工程菌XL-Blue（pPNP702）具有更高的催化速度和底物转化率,表明来源于微生物的低分子量的三聚体PNP在核苷类药物和中间体微生物酶法合成中具有更高的应用价值。
- 夏俊刚何逵夫谢希贤徐庆阳陈宁
- 关键词：枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶酶学性质利巴韦林
- 假交替单胞菌XM2107嘌呤核苷磷酸化酶基因克隆表达、重组蛋白纯化及酶学性质被引量：4
- 2010年
- 【目的】嘌呤核苷磷酸化酶(PNP,EC.2.4.2.1)在酶法合成核苷类药物及中间体中具有广泛应用。本文研究的目标是,获得极地嗜冷菌假交替单胞菌Pseudoa lteromonas sp.XM2107嘌呤核苷磷酸化酶编码基因,并对该酶酶学性质进行研究,以考察该酶在核苷类中间体及药物合成中的潜在应用价值。【方法】利用同源序列PCR技术从Pseudoa lteromonas sp.XM2107基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶基因,测序获得编码序列。将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达以及金属螯合层析纯化,对其酶学性质进行初步研究。【结果】经过测序获得了该酶编码基因序列,全长702 bp,共编码233个氨基酸,大小为25 kDa,Genbank登录号为GQ475485。酶学性质研究发现,该重组酶最适反应温度为50℃,最适酶促反应pH为7.6(25 mmol/L磷酸盐缓冲液),最适酶促反应底物为肌苷(Km值0.389 mmol/L,37℃),且对底物腺苷和鸟苷也有磷酸解活性,在普通温度下具有较高催化活性和较好热稳定性。【结论】来源于Pseudoa lteromonas sp.XM2107的嘌呤核苷磷酸化酶在普通温度条件下具有较高的催化活性及良好热稳定性性质,在核苷类中间体和药物合成中具有较广泛的应用价值。
- 王光路夏俊刚谢希贤徐庆阳陈宁
- 关键词：假交替单胞菌嘌呤核苷磷酸化酶酶学性质
