湖北省自然科学基金(2009CDB336)
- 作品数：4 被引量：6H指数：2
- 相关作者：周婷黄巍刘桥孙红霞熊波更多>>
- 相关机构：武汉市医学科学研究所武汉市疾病预防控制中心武汉大学更多>>
- 发文基金：湖北省自然科学基金武汉市卫生局科研项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Kozak序列(+4G)对携带EGFP标签的人淀粉样前体蛋白751在CHO细胞中表达的影响被引量：1
- 2011年
- 目的:观察Kozak序列(+4G)对稳定转染的人淀粉样前体蛋白(hAPP751)-EGFP融合真核表达载体在CHO细胞中表达的影响,为APP的水解代谢研究提供细胞模型。方法:分别将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段亚克隆入pEGFP-N1表达载体,得到pEGFP-hAPP751(+4G)和pEGFP-hAPP751重组质粒,转染CHO细胞,通过G418筛选稳定转染细胞株,再用倒置荧光显微镜挑取绿色荧光强的细胞进行亚克隆,并观察融合蛋白的表达强度和细胞定位,最后用EGFP抗体通过Western印迹检测融合蛋白。结果:PCR、酶切和测序证明将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段分别连入了真核表达载体pEGFP-N1中;荧光显微镜下观察pEGFP-hAPP751(+4G)稳定转染细胞的细胞膜和细胞质产生较强的绿色荧光,其中在细胞质中成不均匀颗粒状分布,Western印迹检测到相对分子质量约156 000的融合表达蛋白,与预期相符;pEGFP-hAPP751转染细胞,其绿色荧光十分微弱且在整个细胞均匀分布,Western印迹检测到相对分子质量约26 000的EGFP,但检测不到预期的hAPP751-EGFP融合表达蛋白。结论:Kozak序列(+4G)可以明显促进hAPP751的表达,获得稳定转染且高水平融合表达hAPP751-EGFP的细胞株。
- 黄巍庞蓓蓓熊波周婷刘桥
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白
- APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。
- 黄巍周丽荣周婷孙红霞黄晓刚刘桥
- 关键词：Β分泌酶单链抗体阿尔采末病Β淀粉样蛋白
- 抗人APPβ水解位点单克隆抗体的制备及其初步鉴定被引量：3
- 2010年
- 目的:制备能特异识别结合人APPβ水解位点的单克隆抗体(mAb)。方法:以APPβ水解位点短序列多抗原肽免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过间接ELISA和有限稀释法进行筛选和亚克隆,获得能分泌针对APPβ水解位点mAb的杂交瘤,采用ELISA、Western blot等方法对其特异性进行检测。结果:获得2株稳定分泌抗人APPβ水解位点mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7和2H10,其Ig亚类分别为IgGl和lgG2b。Western blot显示2株抗体可以与全长APP结合。结论:成功制备了能特异识别结合APPβ水解位点的mAb,为进一步研究其对β位点封闭功能和构建小分子抗体奠定基础。
- 黄巍庞蓓蓓周婷熊波周贝刘桥
- 关键词：APP杂交瘤单克隆抗体阿尔茨海默病
- 淀粉样前体蛋白β位点单链抗体抑制β淀粉样肽的分泌被引量：1
- 2015年
- 目的观察淀粉样前体蛋白(APP)β位点单链抗体(sc Fv)对APP的α和β代谢的影响,为其作为APPβ分泌酶特异抑制剂奠定基础。方法以APPβ位点sc Fv 2H10基因序列为模板,通过PCR引入Igκ轻链信号序列和myc标签,与真核表达载体pc DNA3.1hyg(^+)相连,转染过表达人瑞典突变型淀粉样前体蛋白695(APP695)的CHO细胞株(APP695sw/CHO),经潮霉素B筛选出稳定转染细胞株,用夹心ELISA检测稳定转染细胞株培养上清中Aβ40和分泌型APPα(s APPα)的含量,并分别比较两者的变化。结果经PCR、酶切和测序鉴定证明,获得引入Igκ分泌信号和myc标签的APPβ位点sc Fv基因片段,且与真核表达载体正确相连。转染APP695sw/CHO细胞后,经潮霉素B筛选得到稳定转染株;Western blot法可检测到目的蛋白表达,ELISA结果显示,与对照相比,稳定转染细胞培养上清Aβ40分泌量约下降30.4%、s APPα水平上升23.1%。结论 APPβ位点sc Fv在抑制Aβ分泌的同时还可能有利于APP的α代谢,可作为β分泌酶高特异性抑制剂。
- 黄巍周丽荣李小鸥孙红霞周婷黄晓刚刘桥
- 关键词：淀粉样前体蛋白单链抗体Β淀粉样肽
