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雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究被引量：2: 2014年; 目的:初步探讨雷帕霉素在不同浓度和不同孵育时间下,对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的诱导效应及其分子机制。方法:不同浓度雷帕霉素处理HaCaT细胞4 h或12 h后,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测雷帕霉素对细胞活力的影响,并提取蛋白进行蛋白印迹实验,检测LC3-Ⅱ表达水平,作为自噬的检测方法;通过透射电镜分析自噬体形成,确认雷帕霉素对自噬的诱导效果。检测自噬调控上游关键元件哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达及其se^(2481)和ser^(2448)磷酸化产物水平,分析mTOR活性;并分析自噬调控下游的另一关键基因Atg7的表达,初步分析雷帕霉素诱导HaCaT细胞的分子机制。结果:不同浓度雷帕霉素处理4 h,对HaCaT细胞的活力没有显著的影响。高剂量雷帕霉素(80 nmol/L和100 nmol/L)在处理12 h后对HaCaT细胞的活力产生毒性效应。20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h诱导HaCaT细胞LC3-Ⅱ表达上调,而20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育12 h仍具有诱导效应。相较于其他浓度,在50 nmol/L雷帕霉素孵育诱导的LC3-Ⅱ表达上调效应最为显著,并且在药物孵育4h时超微结构水平诱导产生胞质内大量自噬体形成。1~50nmol/L浓度的雷帕霉素孵育4 h或12 h均可诱导HaCaT细胞mTOR ser^(2481)和mTOR ser^(2448)磷酸化产物水平降低:然而Atg7表达不能观测到显著的差异。结论:50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h具有显著的诱导HaCaT细胞自噬效应。HaCaT细胞mTOR分子对雷帕霉素处理敏感,可被其诱导产生蛋白活化抑制效应。这种mTOR信号抑制可能参与了雷帕霉素对HaCaT细胞的自噬诱导效应,但Atg7没有参与这种调控效应。; 陈旭徐松黄丹鞠梅陈崑李新宇顾恒; 关键词：雷帕霉素角质形成细胞自噬

不同剂量长波紫外线照射对HaCaT细胞增殖活力和自噬体表达瞬时影响的研究被引量：2: 2016年; 目的:观察人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞接受不同剂量长波紫外线(UVA)照射后细胞增殖活力和自噬体表达水平的变化,并初步评估增殖活力损伤程度和自噬体表达水平之间的相关性。方法:将HaCaT细胞分为6组,分别为10 J/cm^2UVA对照组、10 J/cm^2 UVA照射组、25 J/cm^2 UVA对照组、25 J/cm^2 UVA照射组、50 J/cm^2 UVA对照组及50 J/cm^2 UVA照射组。照射结束后即刻进行噻唑蓝(MTT)实验或单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色,全波长酶标仪下读取各孔A值,倒置荧光显微镜下随机选取视野,计数每视野下自噬体表达阴性细胞和阳性细胞数目。结果:经不同剂量UVA照射后,HaCaT细胞的增殖活力(A值)下降,呈剂量相关性。其中10、25及50 J/cm^2 UVA照射组(A值分别为1.179±0.007、0.791±0.015、0.522±0.046)两两之间以及与各自对照组(1.370±0.007、1.254±0.012、1.177±0.009)间差异均有统计学意义(P均<0.01);10、25及50 J/cm^2 UVA照射后,HaCa T细胞MDC染色结果示自噬体表达阳性的细胞比率增加,且呈剂量相关性。50 J/cm^2 UVA照射组自噬体表达阳性率较其对照组显著上升(χ~2=11,P<0.01)。结论:10~50 J/cm^2 UVA照射后,HaCaT细胞瞬时增殖活力降低及自噬体表达增加,且呈剂量依赖性。; 苑春雨李莉陈崑陈旭鞠梅黄丹顾恒; 关键词：角质形成细胞自噬体长波紫外线

α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬的影响被引量：1: 2015年; 目的：评价α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法人皮肤成纤维细胞与终浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L 的α硫辛酸孵育4、12和24 h 后，采用噻唑蓝法检测细胞增殖活性，单丹酰戊二胺（MDC）染色法检测细胞自噬水平，Western 印迹法检测微管相关蛋白1轻链3-B（LC3-B）表达。结果孵育4 h 和12 h 时，0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间人皮肤成纤维细胞增殖活性（A490值）差异均无统计学意义（F 值分别为2.85、1.34，均 P 〉0.05）；孵育24 h 时，各组间差异有统计学意义（F =10.41，P 〈0.01）。MDC 法检测显示，孵育4 h 和12 h 时，0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间自噬体阳性细胞百分率差异均无统计学意义（F 值分别为0.11、0.10，均 P 〉0.05）；孵育24 h 时，各组间差异有统计学意义（F =8.03，P 〈0.05）。Western 印迹法检测显示，孵育4 h 和12 h 时，0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间细胞 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ转化（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）水平差异均无统计学意义（F 值分别为3.38、2.13，均 P 〉0.05），但孵育24 h 时各组间差异有统计学意义（F =37.49，P 〈0.01）。结论α硫辛酸可能抑制人皮肤成纤维细胞基础自噬。; 郑云鹏陈旭黄丹徐松顾恒; 关键词：自噬成纤维细胞

血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应研究被引量：1: 2013年; 目的研究血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应，初步分析其分子机制。方法采用血清饥饿处理体外培养的HaCaT细胞诱导自噬，分析血清饥饿对细胞形态和细胞活力（MTr法）的影响。透射电镜观察自噬体囊泡形成，使用Western印迹法进行自噬标志性分子LC3-I-Lc3Ⅱ转化分析和自噬关键基因Atg7的表达以及MDC染色标记自噬体囊泡。对mTOR的蛋白表达及其ser2448和ser2481位点磷酸化产物水平进行分析。结果血清饥饿HaCaT细胞活力上升，电镜观察和MDC染色发现，血清饥饿处理的HaCaT细胞中有自噬体囊泡形成。Western印迹显示，血清饥饿细胞LC3-I—LC3Ⅱ转化（LC3-Ⅱ，LC3-I比率为3．5084-0．415）较正常培养的细胞（0．538±0．038）显著上调（两组比较，t=13．32，P〈0．01）；自噬关键基因Atg7表达上调（对照细胞和血清饥饿细胞Atg7／GAPDH分别为0．021±0．006和0．048-4-0．011，t=7．27，P〈0．05）。血清饥饿处理的细胞中，roTOR的ser2448位点、ser2481位点磷酸化产物水平显著降低（对照细胞和血清饥饿细胞间的磷酸化mTORser2448／mTOR比率分别为0．762±0．108和0．394±0．048，t=7．58，P〈0．05；磷酸化mTORser248I／mTOR的比率分别为0．263±0．039和0．111±0．020，t=13．77，P〈0．01）。结论血清饥饿处理可以诱导HaCaT细胞发生自噬，并且导致细胞活力上升。这种自噬的诱导可能与自噬调控关键元件mTOR蛋白活化抑制相关。; 陈旭徐松张孟丽黄丹任发亮鞠梅李新宇陈岜顾恒郭新云金慧周之海邢美春杜开和; 关键词：角蛋白细胞自噬细胞

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江苏省基础研究计划(BK20131064)

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