国家高技术研究发展计划(2006AA10Z434)
- 作品数：14 被引量：110H指数：7
- 相关作者：殷幼平王中康王国平洪霓袁青更多>>
- 相关机构：重庆大学华中农业大学中国检验检疫科学研究院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划博士科研启动基金湖北省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 柑桔溃疡病菌滚环扩增检测体系的建立被引量：25
- 2008年
- 根据柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)独有的蛋白基因序列和锁式探针公共连接序列分别设计特异性的锁式探针及其扩增引物,优化系列反应条件,建立了特异性的柑桔溃疡病菌滚环扩增体系。初步检测结果表明该体系能够特异性地检出Xac的菌体细胞及其DNA,而检测不出供试的其它植物病原细菌和柑桔叶面常见的多种附生细菌;对Xac靶片段克隆质粒DNA的检测灵敏度为102copy/μL,对Xac菌悬液的检测灵敏度为20cfu/μL,比常规PCR的检测灵敏度稍高。用滚环扩增技术和常规PCR技术对田间采集的实际样品进行了检测,两种方法的检测结果没有显著差异(P>0.01)。由于锁式探针的公共连接序列对扩增的条件要求一致,本体系的建立可以为植物病原微生物多靶标检测和病害检疫检验提供新的技术支撑。
- 黄冠军殷幼平张仑李小焦葛建军陈洪俊王中康
- 关键词：柑桔溃疡病菌锁式探针滚环扩增
- 超分支滚环扩增法检测小麦矮腥黑穗菌被引量：10
- 2009年
- 【目的】建立小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)的超分支滚环扩增(hyper-branched rolling cycle amplification,HRCA)检测体系,为小麦矮腥黑穗病的鉴定以及早期诊断提供了一种新的稳定、可靠的检测技术。【方法】锁式探针包含一个公共连接序列和在探针两端与靶DNA序列互补的2个序列。根据TCK的差异序列设计锁式探针两端序列,以此为基础建立了TCK超分支滚环扩增反应体系。以优化的HRCA反应条件为基础,确定检测体系的特异性和灵敏度。比较HRCA体系和常规PCR体系的性能,并利用这2种体系对来自中国出入检验检疫局截获的51个小麦样品进行了验证检测。【结果】HRCA体系能专一地检出小麦矮腥黑穗菌的DNA靶带,而TCT、TCL等近源种及健康小麦样品都不能扩增。HRCA检测TCK靶序列质粒DNA的下限为1fg·μl-1,检测基因组DNA的下限为10pg·μl-1,检测灵敏度比常规PCR检测体系高10倍。HRCA检测体系具有很好的特异性、灵敏度和准确性,更适合于TCK的检测及鉴定。【结论】稳定、灵敏、特异的小麦矮腥黑穗菌的HRCA检测体系的建立,为小麦矮腥黑穗病的早期诊断及其近源种的多靶标检测提供了同步检测技术。
- 蔡俊殷幼平葛建军陈洪俊黄冠军张雯迪王中康
- 关键词：小麦矮腥黑穗病锁式探针
- 中国柑橘黄龙病病原16SrDNA序列研究被引量：34
- 2008年
- 运用PCR技术对来自中国7省区不同寄主上的黄龙病病原16SrDNA基因区进行了PCR-RFLP-SSCP分析,采用3种限制性内切酶进行单酶切、双酶切及三酶切反应,对酶切产物进行了单链构象多态性(SSCP)分析。结果表明:来自7省区不同寄主上9个黄龙病病原菌分离物的16SrDNA无可见变异;同时对9个有代表性的分离物16SrDNA进行了克隆测序,序列多重比对结果与PCR-RFLP-SSCP一致,从而在分子水平上证明了中国柑橘黄龙病病原菌的16SrDNA序列高度保守,在不同的地域、寄主内没有发现分子变异,为进一步研究柑橘黄龙病病原菌系统进化奠定了基础。
- 丁芳洪霓钟云易干军王国平
- 关键词：柑橘黄龙病病原菌RDNA
- 柑橘溃疡病菌快速诊断胶体金速测卡的研制被引量：2
- 2012年
- 将制备并提纯的抗Xcc单克隆抗体、多克隆抗体及重组抗体,采用间接ELISA方法对比其效价和特异性,筛选用于胶体金速测卡的最优抗体;采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗Xcc单抗Xcc-2D8,固定于金标垫上;利用双抗夹心原理,将单抗Xcc-2D6和羊抗鼠抗体分别固定于硝酸纤维素膜上,作为检测线(T线)和质控线(C线),经试验条件优化,组装胶体金速测卡密封干燥保存。对Xcc菌悬液及柑橘样本浸泡液进行检查。结果表明ELISA方法筛选出2株特异性强、稳定性好的抗体(Xcc-2D8效价为1:128 000倍、Xcc-2D6效价为1:256 000倍),应用于胶体金速测卡的研发;所研制速测卡对Xcc菌悬液的最低检测下限为1×103～1×104 cfu/mL,对多个地区的206份柑橘样本进行实际检测所得结果与qPCR方法所得结果具有较高一致性(kappa值=95.15%),混杂的柑橘组织液对检测结果无影响,检测时间控制在10min以内,检测常见细菌及植物病菌显示特异性良好,各批次速测卡无批间差异,速测卡保存方便稳定性良好。
- 殷幼平吴瑜佳于红李蒙王中康
- 关键词：胶体金单克隆抗体免疫层析
- 小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌检测标准分子构建被引量：3
- 2010年
- 以小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌为研究对象,采用分子克隆技术,分别构建了该两种真菌分子检测的标准分子。前者包括线粒体2297 bp的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列,后者包括线粒体2.3kb的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列。分别对该两个标准分子进行了性能评估试验,测试结果显示所构建的标准分子具有良好的特异性、均匀性和稳定性,能够满足小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌分子检测需求。
- 李小焦王中康章桂明陈枝楠殷幼平程颖慧王颖向才玉缪建锟
- 关键词：克隆分子检测
- 基于锁式探针的滚环扩增技术在植物病原检测中的应用被引量：7
- 2009年
- 基于锁式探针的滚环DNA扩增技术是一种高灵敏性、高特异性、高通量性的检测技术,本文概述锁式探针和滚环DNA扩增原理,介绍了其最新研究进展,分析该研究领域存在的问题,并展望了相关研究在植物病原生物检测中的应用前景。
- 刘倩李蓓文景芝陈洪俊葛建军
- 关键词：锁式探针滚环扩增植物病原基因芯片
- 香蕉穿孔线虫双重PCR快速检测技术研究被引量：9
- 2007年
- 香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)是国际上公认的植物检疫性有害生物之一,是热带地区果树上最重要的线虫。通过设计的属水平上的特异性引物R1、R2(R1/2)和种水平上的特异性引物RS1、RS2(RS1/2)进行双重PCR扩增香蕉穿孔线虫,可扩增出长度为362和291 bp的2个特异性片段谱带。同时分别对检测体系中反应参数进行优化,最佳延伸温度为51.4℃,引物R1/2与RS1/2最佳浓度配比为0.2μm o.lL-1/1.2μmol.L-1,并测试检测引物的灵敏度,能进行有效检测的最低起始核酸量为100 pg;同时,也能对单条线虫进行检测以及样品中线虫的检测。专化性测试证明,2对引物能有效地进行香蕉穿孔线虫的快速分子诊断。
- 葛建军曹爱新周国梁赵国柱谢丙炎
- 关键词：香蕉穿孔线虫分子检测双重PCR
- 不同来源的柑橘衰退病毒分离物基因组5′端A、F变异区序列克隆及分析被引量：2
- 2008年
- 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)组群自然条件下存在株系分化现象。本研究利用RT-PCR技术扩增、克隆了来自我国不同地区的21个柑橘衰退病毒分离物的5′端A、F变异区。通过分析发现,不同来源的各分离物在5′端A、F区存在较大的变异。21个分离物A区序列相似性最低为85.8%,最高可达99.8%,平均为95.9%;与GenBank中9个代表性株系的平均相似性为84.2%。F区序列相似性较A区高,为98.0%;相似性最低为94.3%,最高达99.1%。结果显示不同来源的CTV分离物5′端序列A、F区变异较大。
- 丁芳洪霓钟云易干军王国平
- 关键词：柑橘衰退病毒克隆
- 小麦矮腥黑穗菌差异片段筛选与分子检测体系的建立被引量：11
- 2007年
- 采取随机扩增DNA多态性(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)引物介导的半特异PCR技术(RAPD primer mediated hemi-specific PCR,RM-PCR),在从不同地域征集的18个小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)菌株和29个小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries(DC)Tul,TCT)菌株的总基因组DNA中筛选鉴定出TCK独有的大小为1322bp差异基因组片段。根据该片段序列设计筛选出2对特异性引物CQUTCK2/CQUTCK3和CQUTCK4/CQUTCK5,均可以从18个TCK菌株的菌丝体和冬孢子DNA中稳定地扩增出747bp和200bp的单一靶带DNA,而在29个TCT菌株的菌丝体或冬孢子DNA均无任何扩增产物。以腥黑穗菌属通用引物对CQUK6/CQUK7为内置对照,可以确定被检样品是否含PCR抑制物质进而判断检测体系是否正确,同时有效地排除样品检测结果的假阳性和假阴性。采用建立的TCK特异PCR检测技术体系,实现简单而快速地鉴定小麦矮腥黑穗菌冬孢子或罹病小麦组织中侵染菌丝体的目的。
- 年四季殷幼平袁青夏玉先王中康李敏惠
- 关键词：TCT
- 实时荧光定量PCR鉴定小麦矮腥黑穗菌技术研究被引量：13
- 2009年
- 【目的】建立荧光定量PCR体系以准确灵敏的鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)【方法】根据筛选的TCK独有差异基因片段(1322bp)设计特异性引物对CQUTCK4/CQUTCK5和TaqMan探针CQUP1,建立SYBRGreenⅠ荧光染料法和TaqMan水解探针法定量PCR检测体系,并对体系进行优化。【结果】建立的两套定量PCR检测体系的检测下限相当,可达到0.1fg,对应的拷贝数为2.31×104个,检测灵敏度比常规PCR高2～3个数量级,均可成功鉴别出TCK与小麦网腥黑穗病菌(Tilletiacaries(DC)Tul,TCT),并可快速准确检测小麦矮腥黑穗菌冬孢子和检测罹病小麦植株体内的侵染菌丝体。【结论】建立的2种定量PCR检测技术可运用于小麦矮腥黑穗病的早期诊断。
- 年四季袁青殷幼平蔡俊王中康
- 关键词：TCT实时荧光定量PCR
