国家自然科学基金(3970440)
- 作品数：5 被引量：58H指数：5
- 相关作者：陈诗书魏道严戴冰冰唐展云王中和更多>>
- 相关机构：上海第二医科大学上海第二医科大学附属第九人民医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 细菌内同源重组法制备mIL-12腺病毒载体及其体外高效表达被引量：9
- 2000年
- 利用细菌内同源重组法构建含 m IL- 1 2双顺反子重组腺病毒载体 ,其中由 polio IRES连接的 m IL- 1 2 p40和 p35双亚基目的基因片段用 Not +Xho 酶自真核表达载体 pc DNA3/m IL- 1 2中切出 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 p Adtrack- CMV/m IL- 1 2 ,对之线性化后与腺病毒基因组质粒 p Adeasy- 1共转化 BJ51 83菌 ,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒DNA,转染 2 93细胞 ,包装成重组体腺病毒 Ad- m IL - 1 2 . Southern杂交证实 ,p40和 p35基因已被克隆至 Ad- m IL - 1 2基因组中 ;RT- PCR结果显示 ,Ad- m IL- 1 2感染的 MM45T· Li肿瘤细胞中有p40和 p35基因的表达 ,ELISA检测感染 48h细胞的上清中 m IL- 1 2的含量达 88ng每 1 0 6细胞 ,其体外能刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖 ,提高 NK细胞活性及诱导 干扰素的产生 .结果表明 ,利用细菌内同源重组法制备的 Ad- m IL- 1 2重组腺病毒载体是一种方便、高效、成功率高的方法 ,所制备的重组体腺毒在体外能有效表达具有生物活性的 m IL- 1 2 ,为今后的体内应用奠定了基础 .
- 魏道严唐展云陈诗书
- 关键词：腺病毒白介素12同源重组
- 放射诱导经Egr-1启动子调控的腺病毒介导CDglyTK基因的肿瘤靶向表达被引量：13
- 2001年
- 目的 构建由Egr 1基因启动子驱动CDglyTK基因表达的腺病毒载体 ,通过放射诱导调控CDglyTK基因的肿瘤靶向表达 ,用于肝癌的基因 放射治疗。方法 利用细菌内高效同源重组法 ,制备腺病毒载体AdEgr CD/TK。MM45T .Li肝癌细胞感染AdEgr CD/TK后 ,体外观察γ射线照射诱导CDglyTK基因表达及在前药 5 FC、GCV存在的条件下细胞相对存活率的变化。利用荷瘤小鼠肝癌模型观察不同处理的抑瘤效应。结果 体外实验结果显示 ,γ射线照射可明显诱导CDglyTK基因在MM45T .Li肿瘤细胞内的表达 ,并呈剂量依赖性 ;显著增强细胞对前药 5 FC、GCV的敏感性 (P <0 0 1) ;当 5 FC和GCV同时存在时具有明显的协同效应。体内抗肿瘤实验结果提示 ,与单纯肿瘤局部照射 (TLI)、瘤内注射AdEgr CD/TK +腹腔注射 5 FC +GCV等处理组相比 ,瘤内注射AdEgr CD/TK +腹腔注射 5 FC +GCV合并TLI组的抗瘤效果最好 (P <0 .0 1) ,并可使 30 %的肿瘤完全消退 ,且未见全身毒性反应的增加。结论 利用放射调控CDglyTK基因的肿瘤靶向表达 ,是一种安全。
- 魏道严戴冰冰陈诗书
- 关键词：基因疗法基因表达调控肿瘤
- 细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒被引量：18
- 2000年
- 目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒。方法 :CD、TK融合基因CDglyTK自载体 pWZLneoCDglyTK中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 pAdtrackCMV CDglyTK ,将之PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒 pAdeasy 1共转化BJ5 183菌 ,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA ,PacI酶切后转染 2 93细胞包装成腺病毒颗粒 ,采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定 ,利用报告GFP基因对病毒滴度和感染效率进行测定 ,WesternBlot检测感染腺病毒的肿瘤细胞中有无目的基因的表达。结果 :由pAdTrack CMV CDglyTK和 pAdeasy 1共转化BJ5 183菌 16～ 2 0h后 ,可获得 30 %左右的阳性重组体细菌克隆 ,由重组体克隆质粒DNA转染 2 93细胞包装产生的重组体腺病毒 ,经PCR检测表明已含有目的基因 ,且无复制能力腺病毒的存在。纯化所得腺病毒滴度约为 8× 10 12 pfu/L ,当MOI =10 0时 ,腺病毒感染HepG1细胞的效率 >75 % ,WesternBlot证实在感染重组体腺病毒的细胞中有相应基因产物的表达。结论 :细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的Ad CDglyTK在体外能有效表达相应的基因产物 ,为今后的深入研究奠定了基础。
- 魏道严糜军陈诗书
- 关键词：肿瘤基因治疗腺病毒载体CDTK融合自杀基因
- 小鼠Egr-1基因启动子的克隆及其辐射诱导基因表达被引量：8
- 2000年
- 研究克隆小鼠Egr 1基因启动子及其辐射诱导基因表达特性。方法 :用合成的一对引物 ,以BALB c小鼠基因组为模板 ,扩增出 44 9bp大小含 6个CC(A T) 6 GG基序的序列 ,通过亚克隆技术分别将其插入pBluescriptⅡ测序载体和pHGFP S6 5T报告载体中。利用测序载体对克隆的DNA序列进行分析 ,报告质粒载体经Li pofecTAMINE脂质体介导转染COS 7细胞后给予γ射线照射或H2 O2 处理 ,用流式细胞仪观察GFP表达阳性细胞数。结果 :PCR扩增的DNA片段经测序证实与文献报道完全一致 ,报告质粒转细胞实验结果提示 ,照射或H2 O2 处理可经Egr 1基因启动子而诱导GFP(绿色荧光蛋白 )的表达。结论 :成功地克隆了Egr 1基因启动子 ,经照射能诱导报告基因GFP的表达 。
- 魏道严陈诗书王中和
- 关键词：启动子EGR-1基因基因治疗
