黑龙江农垦总局科技攻关项目(HNKXIV-08-07)
- 作品数：7 被引量：54H指数：4
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- 相关机构：黑龙江八一农垦大学更多>>
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- 牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：19
- 2009年
- 为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为244bp和382bp。该方法检测BCV和BRV的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL。应用这一方法能从病料中检测出这2种病毒。结果表明该双重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于这2种病毒性疾病的快速诊断。
- 柳强侯喜林车车刘双翼刘合义
- 关键词：牛冠状病毒牛轮状病毒双重PCR
- 牛冠状病毒RT-PCR检测方法的建立被引量：8
- 2009年
- 刘合义孙留霞王进轶刘双翼王红余丽芸朴范泽侯喜林
- 关键词：牛冠状病毒PCR检测方法犊牛腹泻成年牛水样腹泻
- 牛轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立被引量：14
- 2011年
- 用差速离心法纯化的牛轮状病毒(BRV)分别免疫鼠和兔,制备了鼠抗BRV和兔抗BRV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测BRV的双抗体夹心ELISA方法。该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:兔抗BRV IgG包被浓度为10μg.mL-1,鼠抗BRV IgG工作浓度为5μg.mL-1,样品反应时间60 min,酶标抗体工作浓度为1∶5 000,以OD450 nm≥0.432作为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数小于10%,最低检测浓度为1.41μg.mL-1,并与牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛冠状病毒(BCV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)等病原无交叉反应。用建立的ELISA方法与BRV RT-PCR方法同时检测40份临床粪便样品,符合率达到95%。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有较好的特异性和较高的敏感性,可用于BRV的快速检测。
- 侯美如侯喜林高俊峰刘振格王杰杨明发
- 关键词：牛轮状病毒双抗体夹心酶联免疫吸附试验
- 牛源空肠弯曲杆菌及其HSP43重组蛋白免疫原性研究
- 2010年
- 为评价牛源空肠弯曲杆菌(C.jejuni)及其HSP43重组蛋白(rHSP43)的免疫原性,本研究采用常规方法分别制备白油、铝胶佐剂和不加佐剂的全菌体免疫原和rHSP43免疫原,分别以不同剂量经皮下接种途径免疫6周龄小鼠,应用间接ELISA方法检测两种免疫原免疫小鼠后抗体消长情况,并通过攻毒实验评价其保护效果。结果显示,其产生的抗体水平白油佐剂组要高于铝胶佐剂组,两者明显高于未加佐剂组(p<0.05)。在全菌体免疫原组中,5×109cfu/mL组免疫保护率高于5×107cfu/mL组,前者与5×105cfu/mL组相比较差异极显著(p<0.01)。在小鼠免疫后21d以1×1010剂量的C.jejuni攻菌,全菌体免疫原能够提供完全保护,而以白油佐剂乳化的rHSP43仅能提供75%的保护。本研究结果为C.jejuni的疫苗研制提供了实验依据。
- 张佩鑫侯喜林柳强谢金鑫孙留霞周玉龙
- 关键词：空肠弯曲杆菌免疫原性
- 牛冠状病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立被引量：16
- 2009年
- 为建立牛冠状病毒(BCV)检测方法,利用构建的pET30a-N重组质粒高效表达了BCV重组N蛋白,western blot检测该重组蛋白具有很好的免疫活性。以纯化的蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为1.75μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶200,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶8000,建立了检测BCV抗体的间接ELISA方法。用该法对黑龙江一些地区采集到的256份牛血清样品进行检测,结果阳性率为65.23%,与病毒中和试验方法的检测结果符合率达95.31%。本研究建立的间接ELISA方法为BCV的检测和区域流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法。
- 刘合义孙留霞王进轶刘双翼王红余丽芸朴范泽侯喜林
- 关键词：牛冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测
- 牛冠状病毒N基因的原核表达及初步应用被引量：3
- 2010年
- 目的获得牛冠状病毒N基因的全长序列,实现N基因在大肠杆菌中的高效表达,并进行初步应用。方法根据已发表的牛冠状病毒Mebus株的序列设计引物,对BCV-DQ株进行RT-PCR扩增、克隆和测序;将该基因插入到原核表达载体pET-30a(+)上进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测;用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立ELISA检测方法,对部分临床样本进行检测。结果BCV-DQ株N基因全长1347bp,与GenBank已发表的6株BCV的N基因相比较,核苷酸同源性98.3%以上。构建的重组质粒pET-N能表达出一条大小约为60ku的蛋白,且能与鼠抗BCV血清发生特异性反应。用建立的ELISA方法对黑龙江不同地区送检的共256份牛血清样品进行检测,结果阳性率65.23%,与病毒中和试验的符合率达95.31%。结论BCV N基因保守性很高,并在原核表达系统中获得了高效表达,其表达产物具有良好的免疫反应原性。临床检测结果表明N蛋白可作为诊断抗原用于牛冠状病毒病的流行病学调查。
- 刘合义余丽芸侯喜林孙留霞周玉龙王进轶刘双翼朴范泽
- 关键词：牛冠状病毒N基因克隆原核表达
- 牛冠状病毒DQ株感染BALB/c小鼠的敏感性研究被引量：4
- 2014年
- 为研究牛冠状病毒DQ株（BCoV-DQ）对BALB／c小鼠的敏感性，本研究将该病毒以不同剂量、不同途径感染小鼠，观察比较临床表现、体重变化、剖检及组织病理学变化。分别以100TCID50-700TCID50感染小鼠，结果显示300TCID50病毒可使试验小鼠出现明显的临诊症状和可见的病理变化。采用滴鼻、灌胃、腹腔注射三种途径感染小鼠，结果显示灌胃组个体变化差异大，组织器官病变明显，为最佳感染途径。取主要病变部位组织进行病毒基因组的RT—PCR扩增，证实该病毒可以在小鼠肠道内成功增殖。本实验表明BALB／c小鼠可以作为BCoV．DQ研究的替代动物。
- 刘振格侯喜林余丽芸王宇鹏王杰田斌
- 关键词：牛冠状病毒BALBC小鼠敏感性
