国家自然科学基金(81270532)
- 作品数：21 被引量：122H指数：7
- 相关作者：任锋段钟平张向颖时红波陈德喜更多>>
- 相关机构：首都医科大学附属北京佑安医院山西医科大学第二医院山西医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养项目北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- 氧化应激介导糖原合成酶激酶-3β促进肝细胞凋亡被引量：12
- 2015年
- 目的探讨糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)在氧化应激诱导肝细胞凋亡中的作用。方法以人肝HL-7702细胞为研究对象,H2O2/抗霉素A诱导细胞产生氧化应激,建立肝细胞凋亡模型。SB216763为GSK3β特异性抑制剂,在H2O2/抗霉素A给药前2 h干预。采用钙黄绿素乙酰甲酯/碘化丙啶(PI)双染色观察细胞存活情况,采用annexinⅤ-FITC/PI联合流式细胞术检测细胞凋亡,同时对细胞培养上清进行乳酸脱氢酶(LDH)检测来评价细胞死亡程度;Western blot法检测p-GSK3β、GSK3β、caspase-3、cleaved caspase-3、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和细胞色素C(Cyt C)蛋白的表达。结果 H2O2/抗霉素A诱导的氧化应激促进了GSK3β活性增加,抑制GSK3β活性缓解了氧化应激和由氧化应激引起的细胞凋亡。与氧化应激模型组相比,SB216763干预组中PI染色的细胞显著减少,流式细胞术检测细胞凋亡率降低,细胞培养上清中LDH显著降低,Western blot法结果显示干预组中cleaved caspase-3、JNK、Cyt C蛋白表达下降。结论 GSK3β是氧化应激诱导细胞凋亡通路中的一种重要信号分子,抑制其活性可减轻氧化应激而改善肝细胞凋亡。
- 张向颖郭媛媛张莉温韬朴正福时红波陈德喜段钟平任锋
- 关键词：氧化应激细胞凋亡糖原合成酶激酶-3Β
- 抑制糖原合成酶激酶-3β活性减少肝细胞凋亡保护D-氨基半乳糖/脂多糖诱导的小鼠急性肝衰竭损伤被引量：3
- 2015年
- 目的研究细胞信号分子糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)对D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)联合诱导的小鼠急性肝衰竭肝细胞凋亡的影响。方法腹腔注射D-GalN/LPS建立小鼠急性肝衰竭模型。实验动物分为对照组、模型组、SB216763干预组(建模前2 h腹腔注射)。检测血清ALT、AST,TUNEL法测定肝细胞凋亡,免疫荧光染色法及比色法检测Caspase-3活性,Western印迹检测Cleaved Caspase-3蛋白表达。多组样本均数的两两比较采用一步法ANOVA分析。结果 GSK-3β活性升高促进了在小鼠急性肝衰竭的发生和发展:抑制GSK-3β活性可以显著改善肝脏功能,血清ALT、AST水平明显下降。SB216763干预组ALT与AST水平分别为(961.1±356.0)IU/L和(2 709.9±423.9)IU/L,SB216763干预组与模型组相比,Caspase-3活性降低,TUNEL方法检测肝细胞凋亡减少,并且Cleaved Caspase-3的蛋白表达降低。结论在D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝衰竭中,抑制GSK-3β活性可能通过抑制肝细胞凋亡而改善肝损伤。因此,对信号分子GSK-3β活性进行干预有可能为急性肝衰竭的治疗提供一个新的靶点。
- 魏琳琳张莉杨蓉蓉张向颖温韬段钟平任锋
- 关键词：D-氨基半乳糖脂多糖急性肝衰竭糖原合成酶激酶-3Β凋亡
- 糖原合成酶激酶3β在乙型重型肝炎肝衰竭中的作用研究被引量：5
- 2016年
- 目的探讨细胞内信号分子糖原合成酶激酶（GSK）30在HBV引起的重型肝炎肝衰竭发生过程中的作用。方法收集2009年至2011年北京佑安医院就诊患者中慢性乙型肝炎患者（12例，慢乙型肝炎患者组）和HBV感染引起的重型肝炎肝衰竭患者（12例，乙型重型肝炎肝衰竭组）以及正常人（8例，对照组）的肝组织资料，进行各项临床检测指标的统计分析，用细胞裂解液匀浆提取蛋白，用GSK3D活性测定试剂盒检测肝组织中GSK3D活性，用Westernblot方法检测p-GSK3、GSK3、β-肌动蛋白的表达；制备石蜡切片进行免疫荧光检测。用LSD-t检验进行组间比较，P〈0．05为差异有统计学意义。结果Westernblot结果显示，与对照组相比，慢性乙型肝炎患者组GSK3β第9位丝氨酸磷酸化程度上升，活性下降，重型肝炎肝衰竭患者组GSK3β第9位丝氨酸磷酸化程度显著下降，即GSK3β活性显著上升（P=0．0342）；同时，免疫荧光方法对各组样本进行检测结果显示乙型重型肝炎肝衰竭组GSK3D磷酸化水平显著下降，证明其活性明显增高；最后，GSK3D活性检测试剂盒进行GSK3β活性检测，与Westernblot和免疫荧光结果相一致，重型肝炎肝衰竭患者中GSK3β涪性显著增加，与对照组相比，P=0．0289。结论GSK3活性在重型肝炎肝衰竭发生过程中被激活，因此其是重型肝炎肝衰竭发病机制中的一种重要信号分子，抑制其活性可能在重型肝炎肝衰竭的预防和治疗中发挥一定的作用。
- 张向颖任锋魏琳琳郭媛媛张莉温韬谢棒祥时红波朴正福陈德喜段钟平
- 关键词：肝炎乙型肝功能衰竭
- 糖原合成酶激酶3活性抑制通过激活PPARα对急性肝衰竭小鼠发挥保护性作用
- 2017年
- 目的用D-氨基半乳糖／脂多糖（D-GaIN／LPS）诱导的小鼠急性肝衰竭模型，探讨糖原合成酶激酶3（GSK3）D和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α信号通路在急性肝衰竭中的作用及其机制。方法以C57BL／6小鼠为研究对象，腹腔注射D-Ga1N／LPS建立小鼠急性肝衰竭模型。用SB216763抑制GSK3p活性，用PPAR仅siRNA抑制PPARα表达。Westernblot检测小鼠中PPARα蛋白表达情况。观察小鼠肝组织病理变化情况以评价肝脏损伤情况，检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）评价肝脏功能。实时荧光定量PCR检测肝组织中肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）-1β、IL-12p40mRNA和PPARα基因表达水平。多组样本均数的比较采用单因素方差分析，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Games-Howell法。结果在D-GalN／LPS诱导的肝衰竭小鼠中，抑制GSK3p活性促进了PPARα的mRNA（0．29±0．05与0．17±0．02，F=13．18，P〈0．01）和蛋白（0．79±0．05与0．15±0．04，F=301．36，P〈0．01）表达水平。在D—Ga1N／LPS诱导的急性肝衰竭小鼠中，抑制GSK3β活性减轻了小鼠肝脏出血、炎症和坏死，降低了血清肝功能指标ALT（572．0±127．8与1627．0±412．4，F=25．16，P〈0．01）、AST（479．2±229．2与1359．0±534.8，F=12．96，P〈0．01）水平，也降低了肝组织中炎症因子TNFα（F=32．17，P〈0．01）、IL-1β（F=11．57，P〈0．01）、IL-12β40（F=14．17，P〈0．01）mRNA表达水平。抑制PPARα表达逆转了GSK3p活性抑制带来的肝保护性作用，表现在肝脏出血、炎症和坏死加重，血清肝功能指标AIT（1433．0±464．0与708．7±196．2，F=25．16，P〈0．01）、AST（1361．0±583．2与352．7±177．4，F=12．96，P〈0．01）水平升高，肝组织中炎症因子TNFα（F=32．17，P〈0．01）、IL-1β（F=11．57，P〈0．01）、IL-12p40（F=14．17，P〈0．01）mRNA表
- 时红波时红林张向颖陈德喜段钟平任锋
- 关键词：脂多糖类糖原合成酶激酶3过氧化物酶体增殖物激活受体ΑD-氨基半乳糖
- 细胞自噬在D-氨基半乳糖/脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤模型中的保护作用及机制被引量：14
- 2017年
- 目的利用D-氨基半乳糖(D-Gal N)/脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝损伤模型研究细胞自噬在急性肝损伤中的作用及机制。方法以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射D-Gal N/LPS建立小鼠急性肝损伤模型。动物实验分组:对照组、DGal N/LPS组、雷帕霉素+D-Gal N/LPS组、三甲基腺嘌呤(3-MA)+D-Gal N/LPS组、Atg7 siRNA+D-Gal N/LPS组。观察不同分组中小鼠的生存情况,观察肝组织病理变化评价肝损伤情况,全自动生化分析仪检测血清ALT、AST水平,实时荧光定量PCR检测肝组织中TNFα和IL-6基因表达,荧光显微镜观察肝组织中肝细胞凋亡情况。多样本组间比较采用One-way ANOVA分析,进一步两两比较,方差齐时采用LSD-t检验,方差不齐时采用Games-Howell法。结果与D-Gal N/LPS组相比,应用自噬激活剂雷帕霉素干预后,小鼠生存率明显升高(80%vs 40%),肝脏出血、炎症和坏死明显减轻,肝细胞凋亡明显减少,血清ALT、AST水平明显降低[ALT:(427.4±195.5)U/L vs(977.7±247.3)U/L,P=0.002;AST:(378.2±169.7)U/L vs(1100.0±438.0)U/L,P=0.004],肝组织中炎症因子TNFα和IL-6 mRNA表达水平明显降低[TNFαmRNA:0.288±0.010 vs 1.136±0.267,P=0.003;IL-6mRNA:0.272±0.061 vs 0.869±0.317,P=0.010];应用自噬抑制剂3-MA和Atg7 siRNA干预后,小鼠生存率明显降低(0、10%vs 40%),肝脏出血、炎症和坏死明显加重,肝细胞凋亡明显增多,血清ALT、AST水平明显升高[ALT:(1836.0±560.5)、(1654.0±627.6)U/L vs(977.7±247.3)U/L,P值分别为0.006、0.034;AST:(1948.0±645.5)、(1804.0±492.6)U/L vs(1100.0±438.0)U/L,P值分别为0.029、0.033],肝组织中TNFα表达水平明显升高[2.026±0.342、1.994±0.286 vs 1.136±0.267,P值分别为0.006、0.005]。结论在D-Gal N/LPS诱导的小鼠急性肝损伤中,细胞自噬发挥着重要的保护性作用,其调控机制可能与自噬抑制炎症因子和肝细胞凋亡有关。
- 时红波时红林张向颖陈德喜段钟平任锋
- 关键词：脂多糖类
- 内质网应激调控糖原合成酶激酶3β活性在小鼠急性肝衰竭致病中的作用被引量：1
- 2016年
- 目的：研究严重内质网应激介导糖原合成酶激酶3β（ GSK3β）活性在小鼠急性肝衰竭肝损伤病理机制中的作用。方法以C57BL／6小鼠为研究对象，腹腔注射D-氨基半乳糖（ D-GalN）和脂多糖（ LPS）诱导小鼠急性肝衰竭模型。动物实验分组：阴性对照组（ n＝10）、急性肝衰竭模型组（n＝18）、4-丁酸苯酯（4-PBA，内质网应激抑制剂）干预组（n＝18）和SB216763（GSK3β特异性抑制剂）干预组（n＝16）。检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）评价肝脏功能，观察肝脏组织病理变化评价肝脏损伤情况，免疫印迹方法检测肝脏组织中蛋白表达水平， GSK3β活性检测试剂盒检测肝脏组织中GSK3β活性改变，四甲基偶氮唑盐（ MTT）法检测细胞生存率。结果体内实验表明，在D-GalN／LPS诱导的急性肝衰竭过程中，内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白78（ GRP78）和特异性凋亡分子CCAAT／增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的表达逐渐升高，提示严重内质网应激被激活，同时GSK3β活性也逐渐升高。4-PBA抑制内质网应激可显著改善肝脏功能[ALT：（365.4±58.6）比（1094.5±201.5）U／L；AST：（555.1±60.8）比（1444.3±533.7）U／L，均P＜0.05]和病理损伤，此外，4-PBA还抑制急性肝衰竭小鼠肝脏中GSK3β的活性（2.6±0.3比4.6±1.3，P＜0.05）。进一步研究表明，抑制GSK3β活性能够下调CHOP和GRP78的表达而改善急性肝衰竭肝损伤。衣霉素诱导肝细胞凋亡的体外实验表明，抑制GSK3β活性能够促进细胞生存。结论在D-GalN／LPS诱导的急性肝衰竭过程中，严重内质网应激通过上调GSK3β活性而促进急性肝衰竭的发生和发展。
- 高虹张向颖岳莉英刘兆玉贾妮娜陈德喜段钟平任锋
- 关键词：炎症内质网应激糖原合成酶激酶3Β
- 外泌体在肝脏疾病中的作用研究被引量：7
- 2017年
- 外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡之一。囊泡是由磷脂双层包围的球形颗粒,根据大小可分为三种类型小泡：外泌体（40~100 nm）、凋亡小体（1~4μm）和微粒（0.1~1μm）[1]。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体中含有多种物质,包括蛋白质、信使RNA（messenger RNA,mRNA）和微RNA（microRNA,miRNA）,
- 任彩瑗任锋
- 关键词：肝脏疾病胞外基质溶酶体凋亡小体小泡肝癌细胞系
- GLT25D2基因在对乙酰氨基酚诱导肝毒性损伤中对自噬的调控作用被引量：2
- 2018年
- 目的探讨GLT25D2基因在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝毒性损伤中是否对自噬有调控作用。方法选择GLT25D2/野生型C57B/J小鼠和GLT25D2/基因敲除C57B/J小鼠为研究对象。①体内实验：将20只野生型小鼠和20只GLT25D2/小鼠分别按随机数字表法分为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组和APAP干预组，每组10只。腹腔注射25 /的APAP溶液500 m/g建立小鼠肝毒性损伤模型；PBS对照组腹腔注射等量PBS。制模成功后立即处死小鼠取肝组织，采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测肝组织自噬相关蛋白ATG5、ATG7、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、P62的表达；电镜下观察肝组织超微结构改变，评估自噬水平。②体外实验：另取野生型小鼠和GLT25D2/小鼠各1只，采用两步胶原灌注法提取原代肝细胞并分为两部分：一部分以5 mmo/ APAP溶液干预0、8、12 h后收集细胞，采用Western Blot试验检测肝细胞自噬相关蛋白ATG5、ATG7、LC3、P62的表达；另一部分用绿色荧光蛋白-LC3质粒（GFP-LC3）转染24 h，分别给予PBS（PBS对照组）和5 mmo/ APAP（APAP干预组）温育12 h，荧光显微镜下观察GFP-LC3阳性表达以反映自噬体的形成情况。结果①体内实验结果显示：与相应PBS对照组相比，经APAP干预后，野生型及GLT25D2/小鼠肝组织中自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7、LC3 -Ⅱ表达下调，而负性相关蛋白P62表达上调，说明APAP处理后自噬整体水平降低。与野生型小鼠相比，GLT25D2/小鼠肝组织自噬正性相关蛋白ATG7、ATG5表达上调（ATG/-actin：1.21±0.29比0.84±0.19，ATG/-actin：1.29±0.14比1.54±0.40，均P〉0.05），LC3 -Ⅱ表达略下调（LC3 -/-actin：0.52±0.06比0.58±0.06，P〉0.05），而负性相关蛋白P62表达下调（P6/-actin：1.13±0.94比1.54±0.40，P〉0.05），说明基因敲除后小鼠自噬表达水平高于野生型小鼠。电镜下观察超微结构显示，与相应PBS对照组相比，经APAP干
- 郭乐乐刘贞利张晶任锋
- 关键词：自噬对乙酰氨基酚
- 内质网应激在乙型重型肝炎(肝衰竭)中的作用研究被引量：11
- 2019年
- 目的探讨内质网应激在乙型肝炎病毒(HBV)感染后引发的重型肝炎(肝衰竭)(重型肝炎肝衰竭)过程中的作用及其相关机制。方法收集2009—2011年首都医科大学附属北京佑安医院就诊患者中慢性乙型肝炎患者(12例,慢性乙型肝炎患者组)和HBV感染所引发的重型肝炎肝衰竭患者(12例,乙型重型肝炎肝衰竭组)以及正常人(8名,对照组)的肝组织标本和临床资料。对各组临床检测指标进行统计分析;选用透射电镜对肝组织内质网结构进行观察;用蛋白质印迹法和qRT-PCR检测内质网应激和凋亡相关因子葡萄糖调节蛋白(Grp)、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)等的表达;制备冰冻切片进行免疫荧光检测。所有数据以均数±标准差(±s)表示,用LSD-t检验进行组间比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果透射电镜检测结果表明,慢性乙型肝炎组和重型肝炎肝衰竭组内质网形态结构均受到破坏,且重型肝炎肝衰竭组更为严重;蛋白质印迹法和qRT-PCR结果显示Grp78、Grp94、胱天蛋白酶4在正常组和慢性乙型肝炎组表达较高,蛋白相对表达量分别为1.20±0.13和0.78±0.11、0.90±0.06和0.11±0.01、0.15±0.02和0.22±0.04;在重型肝炎肝衰竭组表达减弱(蛋白相对表达量分别为0.01±0、0.01±0、0.11±0.02),且与正常组差异有统计学意义,P值均<0.05;而CHOP表达与免疫荧光结果一致,随着损伤的加重而增强。结论内质网应激在乙型肝炎重症化过程中失调:慢性乙型肝炎阶段引发轻度内质网应激,而在重型肝炎肝衰竭阶段引发重度内质网应激。因此,内质网应激在重型肝炎肝衰竭发病过程中起到重要而又复杂的作用。
- 王慧娟徐玲田原张向颖时红波陈煜段钟平张桓虎任锋
- 关键词：肝衰竭内质网应激
- 细胞自噬在D-氨基半乳糖／脂多糖诱导小鼠急性肝衰竭中的表达被引量：8
- 2016年
- 目的利用D-氨基半乳糖／脂多糖（D—GalN／LPS）诱导的小鼠急性肝衰竭模型，研究细胞自噬在肝衰竭疾病进展过程中的表达及其作用。方法以C57BL／6小鼠为研究对象，腹腔注射nGalN／uIS建立小鼠急性肝衰竭模型。动物实验分组：对照组、D—GalN／LPS诱导肝衰竭模型2h组、D-GalN／LPS诱导肝衰竭模型4h组和D-GalN／LPS诱导肝衰竭模型6h组。检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）评价肝脏功能，观察肝脏组织病理变化评价肝脏损伤情况，实时荧光定量PCR检测自噬相关基因表达，Westernblot测定小鼠肝组织中自噬相关蛋白表达，荧光显微镜观察肝衰竭进展过程中自噬体的表达情况。多组样本均数的两两比较采用One-wayANOVA分析（方差齐者用LSD—t检验，方差不齐者用Games-Howell法），尸〈0．05为差异有统计学意义。结果急性肝衰竭模型组肝功能随着D—GalN／I鹧刺激的进展逐渐受损：ALT、AST在4h后显著增高，肝脏组织病理损伤随时间逐渐加重，6h达到急性肝衰竭标准；自噬相关基因ATG-7、ATG-5、Beclin-1、Lamp-1和LC3amRNA和蛋白在急性肝损伤早中期（2h和4h）表达增高，而进展至肝衰竭（6h）后表达下降；荧光显微镜观察发现给予D—GalN／LPS在4h时间点自噬体的表达最多。结论在D-氨基半乳糖／脂多糖诱导急性肝损伤早中期，自噬表达逐渐增强，而进展至肝衰竭后自噬表达下降，因此细胞自噬可能在急性肝衰竭的发病机制中发挥着重要作用。
- 魏琳琳张向颖张莉杨蓉蓉时红波温韬陈德喜段钟平任锋
- 关键词：自噬肝脏脂多糖类
