国家教育部博士点基金(20030558058)
- 作品数：15 被引量：74H指数：6
- 相关作者：张成于美娟王淑辉冯善伟黄慧更多>>
- 相关机构：中山大学附属第一医院中山大学四川大学更多>>
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- 绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达被引量：3
- 2006年
- 目的:研究重组腺病毒(Ad)对骨髓基质干细胞(MSCs)的转染,以及绿色荧光蛋白(GFP)和成肌调节因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表达.方法:用差速贴壁法体外培养大鼠MSCs,并用流式细胞仪(FCM)检测其表面标志;对构建有绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP)进行扩增和鉴定,并转染MSCs;用RTPCR检测MyoD和Myogenin在转染后MSCs中的表达;将MSCs与C2C12成肌细胞共培养,诱导前者的分化,并用免疫荧光检测MyoD的表达.结果:FCM检测证实,在MSCs的表面标志中CD11b和CD45阴性,而CD29和CD44阳性;随着AdGFP感染复数(MOI)的增加,转染效率也相应提高,但在MOI大于100后,MSCs开始出现病变;RTPCR结果提示MyoD和Myogenin在转染后的MSCs中有表达;免疫荧光检测证实诱导后的MSCs可以表达MyoD蛋白.结论:MSCs可以被AdGFP有效转染而表达GFP;同时内源性成肌调节因子的激活,可以促进MSCs的成肌分化.
- 李美山张成陈松林于美娟张雅妮王淑辉熊符
- 关键词：基质干细胞C2C12MYODMYOGENIN绿色荧光蛋白成肌调节因子
- Emery-Dreifuss肌营养不良症的研究进展被引量：1
- 2006年
- Emery-Dreifuss肌营养不良症是一种相对良性的肌营养不良类型。其遗传方式为X-连锁隐性、常染色体显性和隐性遗传。EMD基因和LMNA基因是引起X-连锁EDMD和常染色体遗传EDMD的致病基因,编码产物分别为emerin蛋白和核纤层蛋白(lamin)A/C。该病确切的发病机制目前尚不清楚,临床特点表现为早期出现关节挛缩,受累肌肉呈肱-腓分布并伴有心脏受累。致病基因的研究使基因治疗该病成为可能。
- 尚延昌王淑辉张成
- 人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达被引量：2
- 2006年
- 目的构建人微小抗肌萎缩蛋白基因(microdystrophin)的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),研究其体外表达情况。方法限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒pcD-NA3.1(+)的NotI位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3.1(+)/micro dystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染入rMSCs中,经过G418筛选后,用RT-PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果pcDNA3.1(+)/micro dystrophin经过NotI、Hind III酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录;对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光,说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染入rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达,为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。
- 王淑辉张成陈松林于美娟张雅妮李美山熊符尚延昌冯善伟申本昌
- 关键词：真核表达转染骨髓间充质干细胞
- 脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞被引量：17
- 2004年
- 目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用,为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法体外培养MSCs至第5代后,分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs,诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数,对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较;诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态;BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长;BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰,而β-ME在诱导2h即达高峰,但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性;RT-PCR显示NSE、NFL,MAP-2的mRNA表达阳性,GFAP有较弱的表达;蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞,而且分化后细胞的存活时间长,有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。
- 黄文张成陈松林张为西姚晓黎曾缨黄慧冯善伟柳太云
- 关键词：骨髓间充质干细胞脑源性神经营养因子神经元诱导分化
- 蛋白转导在基因治疗中的应用被引量：5
- 2006年
- 蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过细胞膜甚至血脑屏障,并在细胞间自由传递。PTD这种能携带融合蛋白自由进入细胞的独特功能为人类一些疾病的基因治疗提供了一种新的运载工具,在基因治疗中有着美妙的应用前景。
- 熊符张成于美娟
- 关键词：蛋白转导蛋白转导域基因治疗
- BDNF诱导骨髓间质干细胞分化中神经元特异性蛋白表达与细胞凋亡的关系被引量：3
- 2006年
- 目的:探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间质干细胞(MSCs)分化中神经元特异性蛋白表达与细胞凋亡的关系。方法:分别用BDNF和β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs分化为神经元样细胞,在诱导1h、6h、12h及24h后用蛋白质印迹法检测神经元特异性蛋白(nestin、NSE、MAP-2及GFAP)的表达,同时用流式细胞仪检测各时点的细胞生长周期及细胞凋亡。结果:蛋白质印迹法结果显示β-ME和BDNF诱导的细胞均能表达神经元特异性蛋白:nestin和NSE,不表达MAP-2;神经胶质细胞特异性蛋白GFAP也有较弱表达。β-ME组诱导12h后nestin的表达转为阴性,NSE表达也减弱,而BDNF组直至24h nestin和NSE表达才渐转阴性;BDNF诱导的细胞S期百分率均较同时点的β-ME组高,β-ME在诱导后12h出现了凋亡峰,BDNF诱导组在观察的时点内均未出现凋亡峰。结论:β-ME诱导细胞的神经元特异性蛋白表达的减少与细胞凋亡在时间上一致,说明分化后细胞死亡的原因可能与凋亡有关;而BDNF诱导细胞的蛋白表达减少与细胞凋亡无关,提示BDNF诱导分化后的细胞死亡可能还与其它因素有关或者BDNF可能有抗凋亡作用。
- 黄文张成陈松林张为西冯善伟柳太云姚晓黎曾樱
- 关键词：骨髓间质干细胞细胞分化细胞凋亡
- 多轴空病患者一例临床和病理特征分析被引量：1
- 2006年
- 王淑辉张成尚延昌文剑明吴金浪于美娟张雅妮
- 关键词：病理特征先天性肌病肌张力低下关节挛缩
- 异基因脐带血干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症一例被引量：7
- 2005年
- 目的 探讨脐带血干细胞移植对假肥大型肌营养不良症(DMD)治疗的可行性。方法对1例确诊为有家族史的11岁DMD患儿经HLA配型,在脐血库中寻找到1份有5个位点相合的干细胞,其细胞数为移植治疗用量的2 6倍。采用白消安、环磷酰胺和兔抗胸腺淋巴细胞球蛋白预处理后进行异基因脐带血干细胞移植治疗;术后给予环孢素A、泼尼松龙和骁悉预防移植物抗宿主反应,前列腺素E1预防肝静脉阻塞综合征,丽科伟预防巨细胞病毒感染,粒细胞刺激因子惠尔血和丙种球蛋白进行对症支持治疗,定期检测血清肌酸激酶(CK)、造血重建、血型转变和PCR STR。结果 移植后第12天外周血白细胞为0. 5×109 /L,第14天1. 0×1.09 /L,中性粒细胞数为0 .6×109 /L, 第37天停用粒细胞刺激因子,白细胞波动在3 .34×109 /L^12 .2×109 /L;第27天血小板>20×109 /L,血红蛋白于第24天上升至88g/L,停用红细胞输注。移植后第42天患儿的血型从移植前的A型转变为AB型(移植干细胞为B型);PCR -STR检测均呈混合嵌入,供者的比例逐渐上升至55% ~65%。第38天出现Ⅰ度移植物抗宿主病,CK从6000U/L降至600~2200U/L。移植后第42天的运动功能较移植前有所改善。结论 异基因脐带血干细胞移植后短期内可恢复造血重建并改善患儿的运动功能。
- 张成陈维肖露露谭恩勋罗绍凯郑冬叶欣李中卢锡林刘颖
- 关键词：脐带血干细胞异基因假肥大型肌营养不良症粒细胞刺激因子造血重建确诊
- 香丹注射液定向诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞被引量：15
- 2004年
- 目的 :研究香丹注射液对成年SD大鼠骨髓间质干细胞 (rMSCs)的诱导分化作用。方法 :rMSCs取自大鼠的下肢骨 ,贴壁筛选法和营养缺陷培养基 (α MEM完全培养液 )分离纯化。加碱性成纤维生长因子 (bFGF)预诱导第 5代的rMSCs 2 4h ,换无血清培养液 (D/F12 +N2 +bFGF)和香丹注射液 (1%～ 5 % )诱导 6～ 8h ,观察细胞形态变化 ;细胞免疫化学和反转录 PCR法鉴定神经元标记物 (神经元特异性烯醇化酶NSE、神经丝蛋白NF 2 0 0、微管相关蛋白MAP 2及胶质纤维酸性蛋白GFAP)的表达及相对表达量 ,并得到相应的诱导率。结果 :诱导 3h ,rM SCs出现神经元样的形态学变化 ,诱导 6～ 8h ,神经元的诱导率达 83 5 %± 3 8% ;诱导组中 ,神经元样细胞NSE、NF和GFAP的阳性率分别为 82 9%± 2 98%、84 1%± 4 4 5 %、3 4 9%± 1 6 7% ;对照组细胞和诱导组未变化细胞上述染色均呈阴性 ;RT PCR法示 :只有诱导组有NSE、MAP 2 (HWM )、GFAP的表达且前两者的表达量均分别高于后者 (P <0 0 1)。结论 :1%～ 5
- 黄慧唐云安张成
- 关键词：香丹注射液诱导率神经元样细胞GFAP骨髓间质干细胞
- Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达被引量：4
- 2007年
- 构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(MSC)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗DMD疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5·58×1012vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdxMSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdxMSCs进行同种异体移植治疗DMD疾病奠定了基础。
- 熊符张成肖少波李美山王淑辉于美娟尚延昌
- 关键词：腺病毒载体DMD
