国家教育部博士点基金(20050565002)
- 作品数：4 被引量：16H指数：3
- 相关作者：刘志昕冯团诚王健华余乃通张雨良更多>>
- 相关机构：中国热带农业科学院海南大学更多>>
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- 相关领域：农业科学更多>>
- 香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备被引量：8
- 2010年
- 用PCR方法从感染香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增外壳蛋白(coat protein,CP)基因。回收目的片段,经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的质粒载体pET30a(+)相连接,酶切验证及测序结果获得了含BBTV CP基因的重组质粒pET30a-CP。将重组质粒转化Codon plus表达菌,在25℃、0.4mmol/L IPTG条件下诱导6h或过夜,经12%SDS-PAGE电泳分析可知,该重组菌表达了一个与预期分子量大小一致的His-CP融合蛋白,约为30ku,且主要以包涵体的形式存在。多次洗涤包涵体后得到高纯度的融合蛋白,用其免疫家兔,获得BBTV CP蛋白抗血清。间接ELISA法测定抗血清效价大于51200。Western blot分析表明,抗血清能与融合蛋白特异性结合。
- 余乃通冯团诚王健华张雨良刘志昕
- 关键词：香蕉束顶病毒CP基因原核表达纯化
- 香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测被引量：8
- 2011年
- [目的]对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation pro-teins,Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。[方法]以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。[结果]应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b-Rep。将重组质粒转化E.coliBL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12%SDS-PAGE电泳分析,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。[结论]利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。
- 余乃通冯团诚王健华张雨良刘志昕
- 关键词：香蕉束顶病毒原核表达抗血清制备
- 香蕉束顶病毒海口分离物Rb蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗血清制备
- 2010年
- 应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。
- 冯团诚余乃通刘志昕
- 关键词：香蕉束顶病毒RB蛋白原核表达
- 香蕉束顶病毒海口分离物NSP基因的原核表达被引量：3
- 2009年
- 应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆NSP(Nuclear shuttle protein)基因的编码区,并通过Gateway技术定向重组到原核表达载体pDESTTM-17中的6×His标签下游,经菌落PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了原核表达载体pDESTTM-17-NSP。阳性克隆转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析和western blot检测,结果显示,融合蛋白以包涵体的形式稳定表达,分子量约为20ku,与预计值相符。通过诱导条件的优化,确定了最佳的融合蛋白表达条件为25℃、0.1mmol/LIPTG条件下诱导4h。从而为制备NSP多克隆抗体和进一步研究NSP的功能奠定了基础。
- 冯团诚王健华刘志昕
- 关键词：香蕉束顶病毒NSP原核表达
