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双剪接型2．2 kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白的反式激活作用被引量：5: 2006年; 目的研究双剪接型2．2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体编码的新蛋白的功能。方法PCR扩增双剪接型2．2kb HBV剪接特异性新基因并克隆于哺乳动物细胞表达载体pcDNA3．1/ HisC。以FuGENE6将此重组载体(pcDNA3．1/HisC-TPds)转染Huh7细胞,采用融合表达的多肽表位(X- press表位)抗体,通过Western blot检测目的蛋白在不同时间段的表达。pcDNA3．1/HisC-TPds分别与β-半乳糖苷酶报告载体psv-β-galactosidase(含SV40启动子/增强子)或pCMVβ(含CMV即刻早期启动子)共转染Huh7细胞,转染后48h裂解细胞并检测胞内β-半乳糖苷酶活性,实验数据以SPSS11．5软件分析。结果克隆420bp双剪接型2．2kb HBV剪接变异体新基因,Western blot显示其在Huh7细胞中表达相应蛋白,以转染后48h为最高。在含有CMV即刻早期启动子或SV40启动子/增强子的报告载体与pcDNA3．1/HisC-TPds质量比为1：10～1：50范围内,共转染有报告载体及pcDNA3．1/HisC-TPds的Huh7细胞内β-半乳糖苷酶活性均大于相应的pcDNA3．1/HisC空白载体对照组,且在1：10～1：40范围内存在剂量-效应关系。结论双剪接型2．2kb HBV剪接变异体编码的新蛋白可反式激活CMV即刻早期启动子及SV40启动子/增强子,提示其可能与HBV致病有关。; 陈婉南黄清玲林建银王林郭丹华林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接反式激活

乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析被引量：6: 2007年; 目的确定乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(terminal protein,TP)抗α-干扰素(IFN-α)的功能区域。方法PCR扩增IFN-α诱导人类6-16基因启动子并克隆入pCAT-Basic中,构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT。以FuGENE6转染该报告载体至Huh7细胞并给予不同浓度IFN-α2a刺激,ELISA法检测细胞内氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的表达,建立Huh7细胞对IFN-α反应强弱的定量判定标准。构建TP(包括Spacer区)基因缺失突变体重组真核表达载体,通过融合表达的多肽表位抗体,Western blot法检测目的蛋白在Huh7细胞中的表达。重组表达载体分别与报告载体p6-16CAT共转染Huh7细胞,转染后48 h给予终浓度为100 IU/ml的IFN-α2a刺激,作用24 h后裂解细胞,通过检测胞内CAT含量高低评价各缺失突变体抗IFN-α作用,并据此确定TP(包括Spacer区)抗IFN-α作用的功能区域。结果获得6-16基因启动子并构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT。转染p6-16CAT的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下CAT表达显著增强,且在IFN-α2a终浓度为100 IU/ml时达到最大。West- ern blot显示TP(包括Spacer区)各基因缺失突变体在Huh7细胞中表达相应蛋白。共转染p6-16CAT及部分/全长TP的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下,胞内CAT值和对照组相比无显著差别,相反,全长TP+部分/全长Spacer使细胞内CAT值显著下降。结论DNA聚合酶Spacer区与HBV抗IFN-α作用密切相关。; 王林柏世玉陈婉南李晖林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 Α-干扰素 DNA聚合酶

肝细胞癌患者B和C基因型乙型肝炎病毒X蛋白的变异特点被引量：8: 2004年; 背景与目的X蛋白是乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)最重要的致病因子之一,它在HBV相关性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发生发展中起着重要作用。目前已知B、C基因型HBV相关性HCC的临床及病理表现不尽相同,但目前尚不清楚这种差别是否与B、C基因型HBVX基因之间的差别有关。因此本实验拟研究B、C基因型间HBVX蛋白氨基酸差异及其在HCC患者中的变异及特点,初步探讨其与HCC发生、发展的关系。方法PCR扩增22份乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性HCC患者血清HBVX基因,克隆、测序并以VectorNTI6.0软件分析其基因型。以DNAMAN软件对标准HBV及HCC来源的HBVX蛋白进行氨基酸同源分析。结果检测的22个HBVX基因片段均属于B或C基因型。B、C基因型HBVX蛋白之间存在14个氨基酸的差异,HCC患者来源的B、C型HBVX蛋白存在4个氨基酸的共有变异,C型HBVX蛋白尚有6个型特异性变异。这些差异或变异氨基酸均位于X蛋白B、T细胞表位或反式激活区及调节区内。结论B、C基因型HBVX蛋白之间存在氨基酸差异,且在HCC中发生基因型特异性变异,这些差异或变异氨基酸可能导致X蛋白免疫学功能及反式激活功能的不同。; 徐晓陈婉南郑大利黄清玲林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 X基因基因型肝细胞癌

乙型肝炎病毒在HepG2细胞中的稳定复制及表达: 2007年; 目的建立HBV HepG2肝细胞株,使HBV能长期稳定地表达抗原并复制。方法将含完整转录单位的1.2倍体HBV DNA经Sal (?)位点克隆入真核表达载体pREP10,构建的重组载体pREP-HBV以Lipofectamine2000转染HepG2细胞,250μg/mL潮霉素筛选抗性细胞克隆。ELISA检测细胞上清液中的HBsAg和HBeAg。电子显微镜下观察细胞上清液HBV颗粒。制备HBV特异性探针,以Southern印迹法检测细胞株内HBV核心颗粒DNA。结果获得含1.2倍体HBV DNA的重组载体,即pREP-HBV,该重组载体转染HepG2细胞后,获得5株潮霉素抗性细胞RHBV1～RHBV5,均能表达HBsAg和HBeAg。Southern印迹结果显示各株细胞均可见明显的杂交拖带,即存在HBV DNA复制中间体。细胞培养上清液浓缩后在电子显微镜下可见成簇的、直径约42 nm的HBV颗粒及直径为22～26 nm的球形颗粒。结论成功建立了HBV稳定复制及表达的HepG2细胞株,目前细胞已传代50次,每3天1次。; 黄清玲柏世玉王林陈婉南林建银林旭; 关键词：转染病毒复制

中国人群HBV和HCV双重感染与肝细胞癌关系的Meta分析被引量：13: 2008年; 目的：综合评价中国人群中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）双重感染者发生肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的危险是否高于单独感染者。方法：检索中国生物医学数据库和Medline，获得1990～2006发表的有关中国人群HBV和HCV双重感染与HCC关系的研究结果，并进行Meta分析。所有文献均为病例对照研究。采用随机效应模型D-L法计算合并0R值及其95％CI。结果：共检索到符合要求的37篇文献，累计病例、对照数分别为4203和5642例。与未感染者相比，HBV、HCV单独感染发生HCC的合并优势比（OR）分别为20．91（95％CI：15．40～28．40）和10．60（95％CI：6．74～16．65）；HBV、HCV双重感染发生HCC的合并优势比（OR）为50．27（95％CI：34．92～72．38）。结论：HBV、HCV感染是中国人群HCC高发的独立危险因素，HBV和HCV双重感染在HCC发生过程中呈协同作用。; 彭仙娥林建银林万松林旭; 关键词：肝炎病毒乙型肝炎病毒丙型 META分析

2.2kb乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对Huh7细胞基因表达的影响被引量：6: 2008年; 目的研究单剪接及双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒基因编码剪接特异性蛋白(分别为TPss及TPds)对Huh7细胞基因表达的影响,探讨其可能的致病机制。方法PCR扩增TPss及TPds编码序列并克隆入pcDNA3.1/HisC。采用FuGENE6将重组表达载体及相应空载体分别瞬时转染Huh7细胞,Trizol抽提细胞总蛋白与总RNA。以Westernblot检测目的蛋白的表达,通过Affymetrix Genechip U133 plus 2.0人类基因表达谱芯片检测Huh7肝细胞基因转录的变化并以半定量RT-PCR进一步验证。结果成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1/HisC-TPss及pcDNA3.1/HisC-TPds,在Huh7细胞中能分别表达TPss(单剪接)及TPds(双剪接)蛋白。TPss蛋白导致Huh7细胞DGKβ(diacyl-glycerol kinase beta)等4个基因转录上调,ZNF652(zinc finger protein 652)等5个基因转录下降;TPds蛋白导致细胞MTSS1(Metastasis suppressor 1)等3个基因转录上调,WARS2基因(Tryptophanyl tRNA synthetase 2)转录下降。结论2.2 kb乙型肝炎病毒基因组剪接体编码剪接特异性蛋白可能影响肝细胞骨架的重塑、细胞内物质代谢等方面,与肝细胞的增生、迁移及代谢异常密切相关。; 陈婉南郭丹华陈金烟林万松林建银林旭; 关键词：RNA剪接

原发性肝细胞癌病人肝组织中螺杆菌的检测及分析被引量：10: 2007年; 目的检测并分析原发性肝细胞癌病人组织中螺杆菌的存在情况。方法取配对的80对肝癌、癌旁组织标本及13例正常肝组织标本，抽提组织DNA，分别以细菌特异性和螺杆菌属细菌特异性16SrRNA基因引物进行巢式PCR检测，RCR产物T-A克隆后进行测序和基因进化树分析；对16SrRNA基因归属于幽门螺杆菌的组织样品，PCR检测幽门螺杆菌特异性26KDa基因及cagA、vacA、rps4、g1mM四个功能相关基因，进一步验证幽门螺杆菌的存在；应用抗幽门螺杆菌抗体对肝癌／癌旁组织及正常肝标本进行免疫组化验测。结果39份肝癌组织标本（39／80，48．75％）及37份癌旁组织标本（37／80，46．25％）检出螺杆菌属16SrRNA基因，其中，肝癌组织及癌旁组织均阳性的共有20例，正常肝组织无一例阳性（P〈0．01）。对其中50份16SrRNA基因的进化树分析提示它们与幽门螺杆菌的同源性超过99％，与此相关的组织样本中，幽门螺杆菌特异性26KDa基因阳性37份，cagA基因阳性8份，g1mM基因阳性9份，vacA基因以及rps4基因未检出。免疫组化显示26份癌组织（26／80，32．5％）及24份癌旁组织（24／80，30．0％）检出幽门螺杆菌，且主要分布于肝窦、汇管区及小肝管，正常肝组织无一例阳性（P〈0．01）。结论原发性肝细胞癌病人的癌组织及（或）相应的癌旁组织内存在螺杆菌，螺杆菌感染与原发性肝癌发生可能存在某种关联。; 陈燕凌叶敬旻佘菲菲唐南洪李秀金王晓茜林旭; 关键词：聚合酶链反应

B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力的比较被引量：3: 2007年; 目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别。方法PCR扩增B、C基因型HBVX基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisC-XB及pcDNA3.1/HisC-XC)。以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2细胞,采用融合表达的X-press多肽表位抗体,通过Westernblot检测目的蛋白在不同时间段的表达。PCR扩增MDR1基因启动子并克隆于萤火虫荧光素酶报告载体pGL3-Basic(重组载体为pGL-MDR)。pGL-MDR分别与pcDNA3.1/HisC-XB或pcDNA3.1/HisC-XC共转染HepG2细胞,转染后48h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性。实验数据以SPSS11.5软件分析。结果成功克隆X蛋白表达载体及MDR1报告载体。Westernblot显示pcDNA3.1/HisC-XB或pcDNA3.1/HisC-XC在HepG2细胞中均能表达HBVX蛋白,以转染后48h为最高。当pGL-MDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1:2～1:4范围内,萤火虫荧光素酶在各转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1/HisC-XB+pGL-MDR组>pcDNA3.1/HisC-XC+pGL-MDR组>pcDNA3.1/HisC+pGL-MDR组(对照组),且存在剂量-效应关系。结论B、C基因型HBVX蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,且B基因型强于C基因型。; 林万松徐晓陈金烟林旭; 关键词：病毒蛋白质类

DNA肿瘤病毒蛋白致肿瘤机制研究进展被引量：1: 2007年; 郭丹华林旭; 关键词：DNA肿瘤病毒肿瘤病毒蛋白质类突变

肝癌患者乙型肝炎病毒全基因组结构分析被引量：13: 2004年; 目的　研究肝细胞癌患者乙型肝炎病毒 (hepatitisBvirus,HBV)全基因组的结构及特点。方法　PCR扩增并克隆乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)阳性肝癌患者血清中HBV全基因组DNA ,测序并进行基因结构分析。结果　获得不同肝癌患者来源的 2 2株HBV全基因组DNA ,均属于C或B基因型和adr或adw2血清型。与标准株相比 ,肝癌患者来源的HBV在表面抗原、核心抗原的B/T细胞表位、X蛋白的反式激活区及增强子Ⅱ、核心启动子区发生了一些有意义的共有变异。结论HBV的基因型与基因变异可能与HBV相关性肝癌的发生发展有关。; 林旭徐晓郑大利林建银; 关键词：肝癌乙型肝炎病毒基因组基因结构克隆

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福建省重大科技项目(2002F005)

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