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葡萄糖氧化酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及发酵优化被引量：2: 2018年; 葡萄糖氧化酶(β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase;EC 1.1.3.4,简称GOD)是生物领域中至关重要的工具酶之一,被广泛应用于食品工业、饲料工业、纺织、医药等行业中。作者构建了一株重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica 1-28,分泌GOD,并进一步运用单因素实验与正交实验在摇瓶水平对其发酵培养基进行了优化。实验结果显示,最佳发酵培养基配方为:甘油20 g/L,酵母膏2.64 g/L,氯化铵2.64 g/L,无水硫酸镁0.13 g/L,磷酸二氢钾0.32 g/L,维生素B13.34×10-4g/L,初始pH值6.0。优化后GOD发酵产量达到11.0 U/mL,较初始发酵培养基GOD产量提高了72%。在此基础上进行3 L罐发酵,重组菌在甘油补料30 g/L,pH为5.0时,28℃发酵190h,发酵液酶活达到81.6 U/mL。; 刘晓筱张娟张娟陈坚; 关键词：解脂耶氏酵母葡萄糖氧化酶发酵优化

枯草芽孢杆菌ZH-Zj016产亮氨酸氨肽酶的发酵控制研究被引量：1: 2013年; 一种通过原生质体转化技术所获得的可产壳氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌ZH—Zj016，在对其发酵条件单因素初步优化的基础上，通过控制最低溶氧、两阶段变温培养、细胞通透性调节等，获得15L自控式发酵罐最适发酵条件：初始pH8．0，装液量8．0L，发酵温度（15h前39％，15h后37％），培养时间28h，接种量7‰（V／V），搅拌转速为250-500r／min，罐压控制在0．06～0．08MPa，通气量1．2vvm，溶氧和搅拌转速相偶联，最低溶氧维持在40％，在此条件下，酶活可达138U／mL，与该菌摇瓶优化条件下相当，是原野生菌15L发酵罐平均水平（6．5u／mL）的21倍。; 汪晓东田亚平; 关键词：枯草芽孢杆菌溶氧

重组枯草芽孢杆菌高产氨肽酶策略与提取工艺优化被引量：5: 2015年; 研究不同的产酶促进剂(渗透压调节剂、表面活性剂、有机酸盐)对重组枯草芽孢杆菌产氨肽酶的影响,并对氨肽酶的提取工艺进行优化。获得产酶促进剂优化组合为:氯化钾0.1 mol/L、吐温802.4μL/m L、L-谷氨酸钠0.6%、酒石酸钾0.7%;优化培养条件为:装液量60 m L/250 m L、初始p H 7.5、接种体积分数5%、转速220 r/min、培养时间36 h。在上述优化条件下,该重组菌株产氨肽酶酶活达232.5 U/m L,是优化前的3.32倍。该重组氨肽酶发酵液经低速离心、双水相萃取、超滤浓缩提取后,回收率达67.23%,纯化倍数为8.29。; 孔峰田亚平; 关键词：氨肽酶发酵优化

rDNA介导的乳酸克鲁维酵母整合型表达载体的构建及初步验证: 2019年; 构建一个适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)稳定的整合型表达载体,并通过鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶基因(AMPD)的表达对该载体进行初步验证。以质粒pMD 19T-simple为空骨架,K.lactis GG799来源的18S rDNA序列为同源重组位点,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的半乳糖苷酶启动子(pScGAL7)为外源基因调控元件,乙酰胺酶基因(amdS)为筛选标记,AMPD为报告基因,构建重组表达载体pTRGA-amdS。载体经Sac II线性化后,去除了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的ori和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),将同源重组片段电转化K.lactis GG799得到重组菌,利用实时荧光定量PCR(RT-QPCR)测定重组菌AMPD基因整合拷贝数为1~3,AMP脱氨酶酶活测定结果表明:酶活与拷贝数呈正相关,含3个整合拷贝的重组菌在半乳糖诱导下酶活提高了32.6%,达到(590±13.33)U/mL。在无选择压力下重组菌连续生长58世代稳定性为98.59%。通过载体pTRGA-amdS的构建与应用实现了外源基因在K.lactis中的稳定表达,初步探究了18S rDNA在同源重组中的作用,为K.lactis的进一步分子改造提供参考。; 孙海烨张梁张梁顾正华丁重阳石贵阳; 关键词：乳酸克鲁维酵母 RT-QPCR 拷贝数

毕赤酵母高效表达整合有CBD的米黑根毛霉脂肪酶被引量：1: 2013年; CBD是一类存在各种水解酶(木聚糖酶,纤维素酶等)中的能够结合并识别纤维素的结合域,能有效地增加酶在底物周围的浓度,增强酶水解底物的能力。尝试将来源于哈茨木霉内切葡聚糖酶Ⅱ(THEGⅡ)的CBD及连接肽基因融合到S7-xyn的N-末端区域中,以期能获得高酶活力的融合米黑根毛霉脂肪酶应用于工业生产,研究通过将融合基因克隆到pPICZαA载体中,构建分泌性表达质粒pPICZαA-CBD-RML,载体经线性化后在毕赤酵母GS115中融合表达。通过与没有融合CBD的RML比较,两者具有相似的最适温度和温度稳定性曲线,而融合蛋白CBD-RML的分泌量提高了17%。研究结果表明,来源于THEGⅡ的CBD可以作为异源蛋白在毕赤酵母中表达的分泌增强子。; 薛冲冲张俊辉林影韩双艳; 关键词：毕赤酵母 CBD 分泌表达

重组大肠杆菌表达铜绿假单胞菌溶血性磷脂酶C被引量：8: 2013年; 【目的】构建产溶血性磷脂酶C(Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株产磷脂酶C(PhospholipaseC,PLC)活性较高的菌株,命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)41;进一步以P.aeruginosa 41基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增获得溶血性磷脂酶C(PLCH)基因,构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3);筛选转化子并检测PLC活性和溶血能力,并初步优化其发酵条件。【结果】成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-plcH;在硼砂卵黄平板上对重组菌进行PLC活性测定,显示重组菌有明显的磷脂酶C活性;在哥伦比亚血琼脂平板上对重组菌进行溶血性试验,表明PLCH具有较强的溶血活性;初步优化摇瓶发酵条件为:5%转接量,37℃、200 r/min下培养4 h添加IPTG至终浓度为0.9 mmol/L,转为25℃、150 r/min诱导培养14 h;优化后重组菌的酶活可达到722.89±0.47 U/mL。【结论】本文成功构建了一株产溶血性磷脂酶C活性较高的重组大肠杆菌菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到了722.89±0.47 U/mL,本实验在国内首次实现了铜绿假单胞菌来源的溶血性磷脂酶C基因在大肠杆菌的胞内表达,该研究为研究磷脂酶C产业化奠定了一定的基础。; 赵金星张梁顾正华丁重阳石贵阳; 关键词：铜绿假单胞菌基因重组溶血活性

重组解脂耶氏酵母生产谷氨酰胺转胺酶酶原的发酵优化被引量：1: 2014年; 谷氨酰胺转胺酶(EC2.3.2.13,TGase)是一种重要的食品酶,广泛应用于食品组分的质构、起泡性及乳化性等功能性质的改善。以一株分泌谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-TGase)的重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica BBETG为研究对象,结合单因素实验与正交实验对其发酵培养基进行优化,以期实现pro-TGase的高产。结果表明,较优的发酵培养基配方为:甘油15 g/L、酵母膏20 g/L、氯化铵2.64 g/L、KH2PO4 0.32 g/L、无水MgSO4 0.25 g/L、VB13.34×10-4 g/L,初始pH值8.0。在该培养基中,重组菌于28℃发酵120 h,获得的pro-TGase经体外活化,酶活达8.47 U/mL,较初始发酵培养基产量提高393%。; 万丹孙科琴刘松王淼; 关键词：谷氨酰胺转胺酶培养基优化

乙肝表面抗原在酿酒酵母中的异源表达被引量：1: 2015年; 乙肝表面抗原HBs Ag是乙肝疫苗的主要组分。从转录水平、翻译水平以及翻译后水平对其进行优化,实现了HBs Ag在重组酿酒酵母中的高效异源表达。与组成型启动子TEF1、TDH3、HXT7、ADH1相比,诱导型启动子GAL1可大幅度提高HBs Ag的表达;与GCCACC和AAAAAA相比,kozak序列TACACA最有利于HBs Ag的翻译表达;而共表达二硫键异构酶pdi对HBs Ag的活性表达具有显著的促进作用。通过3种水平的优化,HBs Ag活性从最初的8.87 IU/g提高至151.08 IU/g;最终,利用Ni柱亲和层析成功获得纯化的HBs Ag,活性为3.32 IU/m L。; 邱玲钱俊佳康振陈坚; 关键词：酿酒酵母乙肝表面抗原启动子 KOZAK序列共表达

重组大肠杆菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的过程优化: 2013年; 以分泌吸水链霉菌(Streptomyces hyroscopicus)谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-TGase)的重组大肠杆菌(Escherichia coli(pBB1-1010))为出发菌株,研究了在3 L发酵罐中补料分批发酵对重组pro-TGase发酵的影响。重组pro-TGase经活化蛋白酶(dispase)处理得到活性酶(TGase)。在甘油初始浓度为8 g/L的TB培养基中,脉冲流加甘油使菌体浓度提高至OD_(600)=43,胞外TGase产量和生产强度分别达到12.71 U/mL和0.18 U/mL/h。采用大肠杆菌合成发酵培养基进行补料分批发酵,诱导时添加150 mmol/L的甘氨酸和20 mmol/L CaCl_2可使TGase产量和生产强度分别提高至15.68 U/mL和0.37 U/mL/h;同时,pro-TGase在重组菌胞内大量累积,使TGase总产量达到30.35U/mL,具有一定的工业应用前景。; 马建龙刘松陈康康张东旭张娟堵国成陈坚; 关键词：谷氨酰胺转胺酶大肠杆菌补料分批发酵

共表达HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡萄糖氧化酶的影响被引量：3: 2016年; 通过增强不可折叠蛋白质响应(UPR)信号途径以及研究不同培养温度下的影响,来提高重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。影响毕赤酵母外源蛋白表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力。通过共表达HAC1基因对不可折叠蛋白信号通路进行调控,摇瓶中改造菌株PP-G-HAC1胞外酶活达到161 U/m L,相比于原始重组葡萄糖氧化酶菌株提高了34%。进一步研究不同温度下过量表达HAC1基因对菌株的生长和分泌外源蛋白的影响,菌株PP-G-HAC1在3 L发酵罐中28℃培养,酶活达到1 008 U/m L,胞外重组蛋白质达到14.43 g/L,相比原始菌株在相同条件下提高了3.12倍。; 顾磊张娟堵国成陈坚; 关键词：重组毕赤酵母葡萄糖氧化酶

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国家高技术研究发展计划(2011AA100905)

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