国家自然科学基金(31272688)
- 作品数：11 被引量：25H指数：3
- 相关作者：叶星田园园孙成飞董浚键卢迈新更多>>
- 相关机构：中国水产科学研究院珠江水产研究所上海海洋大学广西大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家现代农业产业技术体系建设项目国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- Tgf2转座系统在转RFP基因斑马鱼上的应用被引量：2
- 2014年
- 提高目的基因的转植效率与可遗传效率是转基因鱼研制的关键点之一。本研究利用近年开发的金鱼转座子系统进行转基因斑马鱼的研制,探讨其在转基因鱼上应用的可行性。通过PCR方法,改造Tgf2转座子供体质粒pTgf2-EF1α-eGFP,将肌球蛋白轻链2启动子(mylz2)与红色荧光蛋白基因(RFP)定向插入其中,构建可在肌肉组织特异性表达红色荧光蛋白的Tgf2转座子供体质粒pTgf2-Mylz2-RFP。通过显微注射,将Tgf2转座子供体质粒与Tgf2转座酶mRNA共注射于斑马鱼(Danio ririo)受精卵中,共注射受精卵972粒,出膜后存活的仔鱼803尾,其中携带外源基因的仔鱼为615尾,阳性率为76.6%。转红色荧光蛋白基因斑马鱼首代F0培育至性成熟,将其中的10尾F0斑马鱼分别与野生型斑马鱼进行配对繁殖,其中1个组合产生了体表呈现均匀红色荧光的F1个体,因此RFP在F0的整合率为10%。将红色荧光F1个体培育至性成熟并与野生型鱼配对繁殖,F2的阳性个体占69%。本研究结果说明,由Tgf2转座子介导的转基因技术,可有效提高目的基因的转植效率与整合效率,在转基因鱼构建以及相关研究中具有开发应用前景。
- 吴芳叶星邹曙明张莉莉孙成飞田园园白俊杰
- 关键词：斑马鱼转基因红色荧光蛋白
- 尼罗罗非鱼无乳链球菌荚膜多糖合成基因的表达及其与荚膜唾液酸含量、菌株致病性的关系被引量：1
- 2018年
- 为了解尼罗罗非鱼无乳链球菌(GBS)荚膜多糖合成基因的表达及其与荚膜唾液酸含量、菌株致病性的关系,本实验克隆了尼罗罗非鱼荚膜多糖合成基因cps E、cps K和neu A,通过q RT-PCR方法分析了这3个基因在不同培养温度下表达水平的变化,同时通过比色法测定了不同培养温度下GBS荚膜唾液酸含量的变化,通过人工感染实验分析了不同水温条件下GBS对罗非鱼的致病性。结果显示,cps E、cps K和neu A编码的氨基酸序列均具有保守的与荚膜多糖合成相关的酶活性位点,Cps E、Neu A与已知鱼源GBS(Ia和Ib型)和人源GBS(Ia、Ib和II^IX型)相应序列的同源性均达到97%以上,而Cps K与鱼源、人源的序列同源性则分别为56%~100%和27%~100%。在不同培养温度下GBS cps K和neu A基因表达水平的变化与荚膜唾液酸含量的变化一致;在较高温度(28和34°C)下培养的GBS荚膜唾液酸含量及菌株攻毒后罗非鱼的死亡率均随温度的升高而递增,而在22°C下培养的GBS唾液酸含量最高,攻毒后罗非鱼的死亡率却最低。本研究结果表明,GBS Cps K和Neu A在GBS荚膜多糖的唾液酸化中起重要作用,较低温度下GBS荚膜唾液酸的高含量有助于其在宿主体内的潜伏,而较高水温条件下细菌的强致病性可能还与除荚膜唾液酸外的某些重要的毒力因子的表达有关。
- 师红亚董浚键张德锋孙成飞田园园卢迈新叶星
- 关键词：尼罗罗非鱼
- 尼罗罗非鱼无乳链球菌基因缺失株ΔcpsE和ΔneuA的构建及其生物学特性被引量：1
- 2017年
- 为探究尼罗罗非鱼无乳链球菌(GBS)荚膜多糖合成基因cpsE和neuA对菌株生物学特性的影响,本研究利用同源重组的方法,构建了GBS的cpsE与neuA的单基因缺失突变株。具体方法为:用Infusion-PCR的方法分别构建带有氯霉素抗性基因的cpsE与neuA基因敲除重组质粒pSET4s-cpsE和pSET4s-neuA。将构建好的质粒电转化入GBS感受态细胞中,通过改变培养温度实现双交换和质粒丢失,最后经氯霉素抗性筛选获得疑似敲除株。通过菌落PCR、RT-PCR及DNA测序等方法对疑似敲除株进行验证。结果显示GBS的两个突变株ΔcpsE和ΔneuA被成功构建。在此基础上,通过生物学功能分析比较基因缺失突变株ΔcpsE、ΔneuA与野生株在菌株生长速率、荚膜多糖厚度、唾液酸含量和毒力方面的差异。结果发现缺失突变株ΔcpsE和ΔneuA的生长速度与野生株无显著差异,但荚膜多糖厚度、唾液酸含量和菌株毒力均显著低于野生株。进一步研究显示,cpsE是鱼源GBS荚膜多糖合成的关键基因,neuA基因则是荚膜多糖唾液酸化的关键基因,它们的缺失导致了GBS荚膜唾液酸含量的降低,且显著降低了菌株的毒力。
- 师红亚董浚键张德锋孙成飞田园园曾庆凯卢迈新叶星
- 关键词：尼罗罗非鱼无乳链球菌生物学特性
- 尼罗罗非鱼γ-干扰素基因的克隆、结构分析及组织表达被引量：5
- 2017年
- γ-干扰素(interferon,IFN)是调控天然免疫与细胞免疫的一种重要细胞因子,在抵抗病毒入侵和细菌感染中发挥重要作用。该研究从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏组织中扩增到γ-干扰素基因的c DNA,大小为621 bp,编码206个氨基酸。生物信息学分析表明,尼罗罗非鱼γ-干扰素分子(On IFNγ)具有信号肽、IFN特征序列及核定位信号。预测的三级结构与人类IFNγ晶体结构最相似。q PCR检测显示,IFNγ在正常鱼体内的脾脏中表达量最高,其次是肠、鳃和肾脏。感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后,On IFNγ在脾脏、肾和鳃中的表达均显著上调(P<0.05)。On IFNγ在相关免疫器官中的高表达、受感染后的表达上调,说明其在罗非鱼免疫防御中可能具有重要作用。该研究为进一步开展On IFNγ基因的功能研究、探讨其在抗病转基因及抗病选育中的开发应用奠定了基础。
- 余嘉欣吴芳孙成飞董浚键田园园叶星
- 关键词：尼罗罗非鱼Γ-干扰素生物信息学
- 尼罗罗非鱼3种Siglecslike融合蛋白在COS-7细胞中的表达及其结合活性的初步研究
- 2015年
- 为获得尼罗罗非鱼Siglecs like融合蛋白,开展相关Siglecs like蛋白的功能研究,深入了解罗非鱼与无乳链球菌相互作用机制。本研究利用前期构建的3个含Siglecs like ORF的克隆质粒,PCR扩增获得Siglec-1、Siglec-4b和Siglec-14 like的膜外段序列,插入真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc中,双酶切、测序鉴定后转染COS-7细胞。q PCR、Western-blot对目的蛋白的表达进行检测;亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测纯化效率。ELISA检测融合蛋白与GBS的结合活性。测序结果显示,成功构建3个融合蛋白真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc-Siglecs like/Ex。检测结果显示,转染细胞中3个Siglecs/Ex-Fc融合蛋白在mRNA和蛋白水平都有高效表达,且过柱后的融合蛋白具有较高纯度;3个融合蛋白与罗非鱼源GBS的结合活性较对照组均有显著差异。研究表明,利用真核表达系统成功制备了具有较高纯度的尼罗罗非鱼3种Siglecs融合蛋白,且均有与GBS的结合活性。
- 魏远征董浚键卢迈新孙成飞田园园叶星
- 关键词：尼罗罗非鱼真核表达结合活性
- 无乳链球菌乳酸-羟基乙酸共聚物微球的制备及其体外释放特点分析被引量：3
- 2014年
- 以乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为材料,采用复乳溶剂挥发法制备无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)全菌及超声破碎后的上清微球疫苗。显微镜观察显示随着PLGA质量浓度、PVA(聚乙烯醇)质量浓度和外水相体积的增加,上清微球平均粒径均随之增大。最终确定上清微球制备条件为PLGA质量浓度25 mg·mL-1、PVA质量浓度1mg·mL-1、外水相体积20 mL。全菌微球制备条件与上述的相比,仅PVA质量浓度调整为2 mg·mL-1。扫描电镜观察显示全菌和上清微球平均粒径分别为9.4μm和3.9μm,微球均呈球形。BCA(二喹啉甲酸)法分析显示包封率分别为68.07%和63.49%;载药量分别为5.49×108个·mg-1和3.58%;28 d体外累积释放量分别为64.2%和82.8%。
- 高铭蔚黎宗强田园园叶星孙成飞董浚键卢迈新
- 关键词：无乳链球菌微球缓释
- 尼罗罗非鱼Siglec-4b like基因的克隆与表达特性分析被引量：2
- 2016年
- 从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)嗜中性粒细胞中克隆了唾液酸结合型免疫球蛋白凝集素Siglec-4b like基因,对其进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测:1)早期胚胎发育过程的表达;2)成鱼组织中的分布;3)人工感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,GBS)后组织表达的变化。结果表明,尼罗罗非鱼Siglec-4b like具有与哺乳类Siglec-4相似的特异性结构域及保守氨基酸残基;早期胚胎发育Siglec-4b like基因在卵子中有一定表达量,受精后7 h即卵裂期表达上调,随后表达下降;Siglec-4b like基因在所检测的各组织中均有表达,鳃的表达量最高,其次是肌肉、皮肤、头肾和肠,其他组织的表达量较低;人工感染无乳链球菌后,Siglec-4b like在鳃、肾与肠等多个组织的表达均呈下调趋势。研究结果为进一步开展Siglec-4b like对罗非鱼免疫系统的调控作用及其与无乳链球菌免疫逃逸机制关系的研究奠定基础。
- 杜娟娟董浚键叶星孙成飞田园园卢迈新
- 关键词：尼罗罗非鱼LIKE
- 罗非鱼无乳链球菌PLGA微球口服疫苗免疫效果的研究被引量：9
- 2015年
- 目的探讨用聚乳酸-羟基乙酸[poly(D,L-lactic-co-glycolic)acid,PLGA]包裹无乳链球菌制备的口服疫苗对罗非鱼的免疫保护效果。方法复乳溶剂挥发法制备包裹无乳链球菌全菌和破碎后上清的PLGA微球,通过口服给予方式免疫尼罗罗非鱼,以注射灭活全菌疫苗为阳性对照,免疫后第7、14、21、28天测定受免鱼血清的白细胞吞噬百分比与吞噬指数、血清中的溶菌酶与超氧化物歧化酶活性以及抗体水平。人工攻毒实验比较罗非鱼无乳链球菌PLGA微球的免疫保护作用。结果实验组鱼的白细胞吞噬百分比、吞噬指数、溶菌酶和超氧化物歧化酶均显著高于阴性对照组,低于阳性对照组;抗体水平也有类似结果,但第14天后阳性对照组鱼的抗体水平开始下降,而实验组鱼则仍维持在较高水平。攻毒实验显示全菌和破碎后的上清微球疫苗相对免疫保护率(RPS)分别为57.63%和34.40%,阳性对照组为94.53%。结论本研究制备的罗非鱼无乳链球菌PLGA微球口服疫苗能够增强罗非鱼对无乳链球菌的免疫反应,并可通过缓释作用使机体维持较高的抗体水平,可为罗非鱼提供一定的免疫保护,但其RPS低于全菌灭活注射疫苗。
- 高铭蔚田园园卢迈新孙成飞董浚键黎宗强叶星
- 关键词：罗非鱼无乳链球菌PLGA微球口服疫苗免疫保护作用
- 尼罗罗非鱼整胚原位杂交技术的建立和初步应用被引量：3
- 2014年
- 为了研究尼罗罗非鱼胚胎发育和器官形成过程中基因功能和基因表达图式,本研究建立了尼罗罗非鱼的整胚原位杂交流程。尼罗罗非鱼的胚胎具有卵黄大、不透明、色素出现早等特点,因此现有鱼类整胚原位杂交方法不能完全适用于尼罗罗非鱼的胚胎,故本研究做了相应的调整和优化:通过提高H2O2的浓度和添加KOH,改良了尼罗罗非鱼胚胎的色素去除方法;使用冷丙酮代替蛋白酶K在提高胚胎通透性的同时保持胚胎完整;减少了探针回收和抗体回收后的洗涤次数,完善了结果的图像采集和胚胎保存方案。使用尼罗罗非鱼的重组激活基因Rag1作为探针基因,整胚原位杂交结果显示Rag1基因表达的位置与已报道的斑马鱼和日本青鳉的Rag1基因在胚胎中的表达位置高度保守,胚胎完整,基因表达位置清晰可见,表明此套尼罗罗非鱼的整胚原位杂交技术流程成功有效。
- 曹建萌卢迈新叶星曾祖聪高风英
- 关键词：尼罗罗非鱼胚胎发育
- 巨核酸酶I-SceI转基因元件的构建及其在斑马鱼中转基因效率的评估
- 2015年
- 巨核酸酶I-SceI是由酿酒酵母线粒体中核糖体大亚基上的Ⅰ型内含子编码的一种核酸内切酶,近年已被应用于转基因研究中。I-SceI介导的转基因大多是将I-SceI蛋白和带有其识别位点的质粒共注射于动物的受精卵,但注射酶蛋白前期处理耗时长且工作量大,直接用I-SceI的mR NA代替蛋白进行注射更为简捷。本研究应用I-SceI mR NA介导荧光蛋白基因在斑马鱼中的转植,进一步了解其转基因效率。首先设计合成带有巨核酸酶I-SceI编码序列的辅助质粒(pC S2-I-SceI),并分别构建了带有巨核酸酶I-SceI识别位点、EF1α启动子和荧光蛋白基因(eG FP/RFP)编码序列的供体质粒pI-SceI-EF1α-eG FP/RFP。辅助质粒pC S2-I-SceI体外转录成mR NA,以50 ng/μL供体质粒和100 ng/μL的I-SceI巨核酸酶mR NA共注射到斑马鱼(Danio rerio)受精卵中,注射后48 h的斑马鱼eG FP的平均荧光表达率可达75.86%。在斑马鱼的头部、躯干到尾部均可观察到荧光蛋白的表达,且随着胚胎发育,荧光信号逐渐增强。结果表明I-SceI系统在斑马鱼中可介导较高效率的转植,具有在经济鱼类转基因研究中应用的潜力。
- 孙成飞董浚键田园园余嘉欣叶星
- 关键词：I-SCEI斑马鱼转基因
