国家自然科学基金(3967067)
- 作品数：8 被引量：25H指数：3
- 相关作者：龚国忠赖力英苏先狮郑宣鹤蒋永芳更多>>
- 相关机构：中南大学湘雅二医院湖南医科大学科罗拉多大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金军队医药卫生科研基金更多>>
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- 丙型肝炎病毒NS5A对p53活性调控机制研究被引量：19
- 2003年
- 目的研究HCV NS5A对抑癌蛋白p5 3活性的抑制作用及其作用机制.方法采用荧光素酶报告基因系统观察pwwp-luc,pwwp-mut-luc,pC53-NS3及pCNS5A分别转染或共同转染HepG2、Huh7细胞的荧光素酶活性.应用凝胶滞留试验观察HCV NS5A是否影响p5 3与其特异DNA序列的结合.结果内源性p5 3能激活p21启动子转录功能,使荧光素酶活性明显增加(3.49×105与0.60×105,t=5.92,P＜0.01).外源性p 5 3也能激活p21启动子转录功能,荧光素酶活性为5.6 3×105,与对照组(0.47×105)比较差异具有显著性(t=10.12,P＜0.01).HCV NS5A能抑制内源性和外源性p5 3对p21启动子的激活作用,并呈剂量依赖性(F≥20.71,P＜0.01).凝胶滞留试验显示HCV NS5A能阻碍p5 3与其特异DNA序列的结合.结论HCV NS5A能抑制p5 3的反式激活功能使其目的基因p21启动子的转录功能下降,其机制是HCV NS5A能阻碍p 5 3与其特异DNA序列的结合.
- 龚国忠蒋永芳朱映华苏先狮
- 关键词：丙型肝炎病毒NS5AP53蛋白
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白5A影响p53抑制肝癌细胞甲胎蛋白表达的分子机制被引量：3
- 2005年
- 目的了解丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对p53抑制甲胎蛋白(AFP)基因表达的影响及分子机制。方法采用质粒转染技术及微粒体酶免疫法观察p53蛋白对Huh7肝癌细胞AFP表达的抑制作用及HCV NS5A对其抑制作用的影响;蛋白印迹实验观察HCV NS5A对p53蛋白表达的影响;谷胱甘肽转移酶沉淀实验鉴定HCV NS5A与p53蛋白能否相互作用形成复合物。结果转染pRc/CMV空质粒的Huh7细胞上清液AFP浓度为(14 322±2412)ng/ml,转染pCNS5A质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(13 843±3218)ng/ml,两组问t=1.42,P>0.05;转染pC53-NS3质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(10 241±1326)ng/ml,与上述两组比较,t值分别为2.41及2.38,P值均<0.05;pCNS5A和pC53- NS3共转染者AFP浓度为(14 582±1238)ng/ml,与pC53-NS3单独转染组比较,t=3.12,P<0.01; pCNS5A和pC53-NS3共转染者和pC53-NS3单独转染者Huh7细胞p53蛋白表达无变化。在谷胱甘肽转移酶沉淀实验中,加入谷胱甘肽-p53融合蛋白后出现HCV NS5A蛋白条带,而仅加入谷光甘肽者则未出现此条带。结论p53蛋白能抑制Huh7细胞AFP的表达,HCV NS5A能减轻p53蛋白对AFP表达的抑制作用。HCV NS5A不影响p53蛋白的表达但能与p53蛋白结合形成复合物是使p53功能失活的分子机制。
- 龚国忠蒋永芳何艳赖力英许允苏先狮
- 关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白5AP53肝癌细胞分子机制
- 丙肝病毒在外周血单个核细胞中的感染状态的进一步研究
- 2000年
- 赖力英龚国忠郑宣鹤肖乐
- 关键词：外周血单个核细胞
- 全文增补中
- 49例输血型丙型肝炎患者病毒基因型鉴定及干扰素治疗效果观察被引量：2
- 2001年
- 目的 了解湖南地区输血后丙型肝炎病毒基因型分布情况 ,分析干扰素治疗效果的影响因素。方法采用混合引物PCR法检测 49例湖南地区输血后丙型肝炎基因型。根据ETR和SR 12生物应答和病毒应答率指标研究影响干扰素疗效的主要因素。结果 49例病人可分型者 46例 ,全部为Ⅱ (1b)型 ,未发现其他基因型。 3例病人未能分型。对完成疗程的 2 6例基因Ⅱ型丙肝患者给予正规疗程干扰素治疗 ,结果显示感染时间是影响干扰素疗效的主要因素。感染时间在一年以内 ,ETR生化应答率和病毒应答率分别是 85 7% (12 / 14)和 78 6 % (11/ 14) ,SR 12生化应答率和病毒应答率为 6 4.3% (9/ 14)和 5 7.1% (8/ 14) ,这些指标均显著高于感染时间大于一年的病人(4 1 6 %、33 3%、16 7%和 8 33% )。结论 湖南地区输血后丙型肝炎HCV基因型主要为Ⅱ (1b)型。感染时间的长短是影响干扰素应答的主要因素 ,早期抗病毒治疗对基因Ⅱ型HCV感染仍能取得较满意疗效。
- 龚国忠郑宣鹤黄力赖力英
- 关键词：输血后丙型肝炎基因型干扰素
- 抗HBcAg人源性单链抗体细胞内表达及其抗病毒复制的实验研究
- 2002年
- 应用人源性抗HBcAg单链抗体细胞内表达技术 ,探讨抗HBV复制基因治疗的应用价值。应用噬菌体展示和基因重组技术 ,从HBV感染的外周血淋巴细胞克隆了人源性抗HBcAg单链抗体 ,并重组至逆转录病毒载体。以人肝癌细胞smmc - 772 1和PLC/PRF/5为靶细胞进行基因共转染 ,分别测定实验组细胞上清中的HBsAg和HBeAg ,与对照组做比较 ,观察抗HBcAg单链抗体细胞内表达的抗病毒治疗作用。结果显示 ,在急性HBV感染的细胞株中 ,抑制病毒复制效率为 4 9%～ 6 1% ,在慢性病毒感染细胞 ,抑制率为 4 1%～ 5 4 %。实验结果表明 ,应用单链抗体细胞内表达技术 ,在抗病毒治疗研究中具有潜在的应用价值。应对HBV的 4个开放阅读框架编码产物进行全面的对比研究 ,以发现抑制效率高。
- 朱明华顾广玉段凌浔李芳梅肖农戴益民
- 关键词：细胞内表达乙型肝炎病毒核心抗原细胞内免疫基因治疗
- 核酶在细胞外切割HCV核心区RNA的研究
- 2001年
- 目的 研究核酶在细胞外切割HCV的作用。方法 设计核酶cDNA序列。构建核酶重组质粒及HCV核心区基因cDNA重组质粒。分别进行体外转录 ,并加入γ 3 2 PATP以标记HCVRNA。将核酶RNA、HCV核心区RNA、RNA酶抑制剂及反应缓冲液混合温育 ,以核酶RNA切割HCVRNA。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影来分析结果。结果 β 半乳糖苷酶表型筛选均可见蓝色及白色菌落生长 ;核酶重组质粒直接测序结果见预期核苷酸序列 ;HCV重组质粒限制性酶切分析见 410bp条带。核酶切割反应显示 :反应时间为 15和 30min时可见 45 3、30 7、146nt3条带 ;反应时间为 6 0min时仅见 30 7及 146nt2条带。结论 核酶重组质粒构建成功 ,所设计核酶对HCV有切割作用。
- 丁芹龚国忠郑宣鹤游学科
- 关键词：核酶丙型肝炎病毒基因治疗RNA丙型肝炎
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白5a对细胞周期的影响被引量：3
- 2004年
- 丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎、肝硬化的主要病因之一,并与肝细胞癌的发生关系非常密切.但HCV导致原发性肝细胞癌的机制,特别是其基因产物(结构蛋白和非结构蛋白)在致癌中的作用仍不清楚.HCV非结构蛋白5A(NS5A)能激活多种转录因子,并与细胞内因子结合,影响其功能,导致细胞增殖分化异常,可能与原发性肝细胞癌的发生有关.为进一步探讨它们之间的联系,采用放线菌素D(Act.D)作用于HepG2肝癌细胞株研究HCV NS5A对细胞周期调控的影响,从而为阐明HCV参与肝细胞癌的分子机制积累更多的资料.
- 龚国忠Aleem Siddiqui苏先狮
- 关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白5AHCV细胞周期肝硬化
- 丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究
- 2000年
- 目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )阳性血清 (抗HCV阳性及HCVRNART PCR阳性 )感染HepG2细胞 ,以期建立稳定的HCV感染的细胞模型。方法 :采用丙肝阳性血清连续感染法感染HepG2细胞 ,用逆转录多聚酶链反应检测传代HepG2细胞内HCVRNA正链和负链 ,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒 ,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原 (HCVNS5、HCVcapsid)的存在。结果 :感染后传代的第一代至第三代细胞内检出HCVRNA正链及负链 ;在感染后传代的细胞内发现球形、密集分布的类丙肝病毒颗粒 ,直径为 30～ 6 0nm ;免疫金银染色发现部分细胞内有聚集的银染颗粒 ;免疫电镜检查在细胞胞浆的囊泡样结构中发现聚集的金颗粒。结论 :HCV可在HepG2细胞内复制 ,可形成病毒颗粒 ,可随细胞传代。
- 赖力英龚国忠曾庆善郑宣鹤张淑安
- 关键词：HEPG2细胞免疫组化丙型肝炎HCV
