福建省教育厅资助项目(JK2012009)
- 作品数：11 被引量：27H指数：4
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- 基因改造AiiA蛋白在毕赤酵母中的表达被引量：6
- 2015年
- 基于毕赤酵母基因组偏好密码子数据表对编码Aii A蛋白的碱基序列进行密码子优化,并构建多拷贝重组Oaii A表达载体p PICZαB-x Oaii A(x=1,2,3),成功表达出具有活性的Aii A蛋白.实验结果表明,优化后Oaii A基因的表达量(2.64 mg·L-1)较优化前aii A的表达量(1.38 mg·L-1)提高约两倍.优化后二拷贝和三拷贝表达量分别为2.84 mg·L-1和2.93 mg·L-1.结果表明密码子优化可以有效提高Aii A蛋白在毕赤酵母中的表达,但是多拷贝表达载体对Aii A的表达促进作用并不显著.提示未来在探索Aii A蛋白在毕赤酵母中的高表达时,通过增加拷贝数来提高产量并不是一个很好的途径,而进行密码子的优化可以有效提高产量.
- 简思美蔡斌斌吴程何晶晶曾世涌杨梅
- 关键词：密码子优化多拷贝毕赤酵母
- 定点突变提高N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活和温度稳定性被引量：3
- 2014年
- 【目的】提高N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AiiA)酶活及温度稳定性。【方法】本研究基于AiiA同源蛋白的三维结构对AiiA进行定点突变,分析野生型AiiA及其突变蛋白酶活和温度稳定性。【结果】野生型AiiA较不稳定,在45℃下温浴30 min,或4℃储存5 d后均失去降解N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)的活性。但是突变AiiA蛋白(N65K,T195R和A206E)的酶活力较野生型AiiA均提高了20%以上,且4℃储存时间延长到7 d。此外,突变株N65K比野生型AiiA对高温具有更强的耐受性,在45℃温浴后剩余酶活力达到45%以上,55℃温浴30 min后仍保留5.0%的酶活力。【结论】通过定点突变改造AiiA蛋白结构,提升了AiiA蛋白的酶活和温度稳定性。
- 杨梅谢盼盼简思美林丽玉杨彩云
- 关键词：N-酰基高丝氨酸内酯酶学特性定点突变
- 小菜蛾β-1,3-葡聚糖识别蛋白βGRP基因的克隆与表达
- 2017年
- 为研究小菜蛾的先天免疫机制,从小菜蛾幼虫体内克隆得到一条β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucan recognition protein,βGRP)基因,利用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白的理化性质、疏水性、结构等方面进行分析与预测,同时构建系统进化树.为研究该蛋白的功能,以大肠杆菌为宿主表达该基因,利用镍柱纯化目的蛋白.实验结果表明,该序列的开放阅读框长1 287 bp,编码428个氨基酸,编码的蛋白质理论分子质量约48.13 ku,理论的等电点为6.18,为亲水性蛋白;进化树分析表明,该蛋白跟家蚕、柞蚕、菜青虫、棉铃虫、冬尺蠖蛾、粉纹夜蝶归为同一大类;经大肠杆菌表达的蛋白均为不溶性的包涵体,通过对包涵体的变性及镍柱的纯化,得到了浓度较高的可溶性目的蛋白.
- 陈少威吴程蔡斌斌杨梅
- 关键词：小菜蛾先天免疫
- 苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达被引量：4
- 2013年
- 根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.
- 曾世涌温真何海滔杨彩云毛惠民杨梅
- 关键词：苏云金芽胞杆菌
- N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA的分子改造及酶学特性
- 2014年
- 革兰氏阴性细菌的群体感应系统利用N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHL)作为主要信号分子诱导致病因子表达,造成细菌性病害.N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AHLase)能水解AHL分子的内酯键,减弱致病菌的危害.本研究利用从苏云金芽孢杆菌克隆的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(auto inducer inactivation A,aiiA),根据Swiss-model模拟aiiA所编码的AiiA蛋白三维结构,预测可能形成的分子内盐桥、活性中心位点等,利用环状诱变方法对AiiA进行定点突变,以期提高其酶活力和热稳定性等酶学性能.对AiiA及其突变蛋白酶学特性分析结果发现,突变体AiiA-N65K-A206E酶活力要比野生型AiiA-wild提高87.4%,并表现出良好的热稳定性和储存稳定性;37℃温浴30 min后酶活力剩余73.9%,比AiiA-wild有了大幅提高;4℃储存120 h后酶活力剩余12.9%,而AiiA-wild丧失酶活力.酶动力学分析表明,AiiA-N65KA206E酶促反应的米氏常数Km为1.23 mmol/L,与野生型相当;最大反应速率Vmax为32.36μmol/L/min,比野生型有较大提高.本研究表明,利用定点突变技术改造AiiA的分子结构,可有效提升AiiA酶活力、热稳定性和储存稳定性.本研究结果为进一步阐明AiiA结构与功能的关系,促进AiiA在植物病害生物防治上的应用,提供了有益的参考和新的思路.
- 杨梅简思美杨彩云谢盼盼曾世涌
- 关键词：定点突变酶学特性
- 基于高通量测序技术研究白甲鱼肠道微生物群落组成被引量：11
- 2018年
- 为研究白甲鱼肠道微生物菌群组成及其多样性.通过高通量测序技术研究白甲鱼肠道内容物菌群组成结构及多样性.结果表明:从36只健康白甲鱼肠道内容物样品中测得白甲鱼肠道中共有22个门,202个物种组成的微生物群.白甲鱼肠道细菌以梭杆菌门Fusobacteria (70. 51±3. 72)%、变形菌门Proteobacteria (22. 55±4. 21)%、螺旋菌门Spirochaetae (2. 84±2. 14)%、厚壁菌门Firmicutes (2. 61±1. 10)%和软壁菌门Tenericutes (1. 12±0. 88)%为主.梭杆菌门中Cetobacterium平均占有(70. 51±3. 72)%的OTUs,是最大的细菌属. Fusobacteria和Proteobacteria为白甲鱼肠道中的优势菌群.实验分析了白甲鱼肠道微生物菌群结构,发现白甲鱼肠道内存在复杂的微生物菌群,为进一步研究白甲鱼对营养物质的吸收利用提供了理论基础.
- 苏月华陈少威吴程蔡斌斌杨梅
- 关键词：白甲鱼肠道微生物高通量测序
- 苏云金芽胞杆菌aiiA的5'端侧翼序列的克隆与功能鉴定被引量：1
- 2018年
- 为了研究苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine Lactonase,AiiA蛋白)表达调控机制,确定aiiA的启动子区域。本研究克隆了aiiA的5'端侧翼区(aP-1930--1),以gfp作为报告基因,分段克隆aiiA的5'侧翼区,鉴定启动子活性,并对aiiA启动子序列中的碱基对-150和-142之间的2个连续的TATA盒进行定点突变。结果显示,侧翼序列aP-295--101和aP-295--1可作为启动子,实现GFP在大肠杆菌中的异源表达,启动子序列aP-295--101比aP-295--1活性更强,aP-101--1序列不能启动GFP表达。定点突变pET28a-aP-295--101-gfp载体2个TATA盒显著降低GFP表达。表明-295--1bp为aiiA的启动子区,-429--296与-100--1序列是aiiA的负调控序列。-150--142 bp区域的2个TATA盒对aiiA的5'侧翼区域的启动子活性起关键的作用。
- 陈少威吴程苏月华蔡斌斌谢盼盼杨梅
- 关键词：苏云金芽胞杆菌启动子定点突变
- 一株日本鳗鲡肠道乳酸菌SOD酶基因克隆表达与应用研究
- 2016年
- 为了解决日本鳗鲡抗生素滥用的问题,探究能够替代抗生素的微生态制剂,从日本鳗鲡肠道中筛选益生菌乳酸菌,克隆其SOD酶基因,并在大肠杆菌中进行表达,将SOD酶、益生乳酸菌同基础饲料配制成3组不同的饲料饲喂鳗鲡后进行血液生化指标分析.实验结果表明,益生菌、SOD酶以及乳酸菌和SOD酶制成的复合酶饲养的鳗鲡的血清总蛋白相对于对照组分别提高2%、8%、18%;葡萄糖相对于对照组分别提高64.8%、19.1%、79.7%;超氧化物歧化酶相对于对照组分别提高10.7%、25.4%、47.1%.各项指标提示添加乳酸菌、SOD酶蛋白有利于日本鳗鲡的生长,在一定程度上提高宿主的抗病能力和免疫性能.
- 吴程蔡斌斌简思美杨梅
- 关键词：鳗鲡乳酸菌超氧化物歧化酶血液生化指标
- 重组毕赤酵母AiiA蛋白表达量的双抗体夹心ELISA测定被引量：1
- 2014年
- 利用双抗体夹心ELISA的方法，建立了能对重组毕赤酵母表达AiiA蛋白进行定量测定的方法．双抗体夹心ELISA方法建立的标准AiiA蛋白曲线显示，随着AiiA蛋白质量浓度增大，显色后A410值增大，在AiiA质量浓度为1．11—35．5μg·mL-1的范围内具有良好的线性关系．经方法学分析表明，该方法对合有AiiA蛋白的发酵样品的检测具有良好的特畀性和精确度，AiiA的检测限为0．80μg·mL-1，批内差畀系数和批间差异系数分别为5．22％和10．30％．测定8．86，2．22，1．11μg·mL-13个质量浓度回收率分别为104％、97．3％和102％，能够满足定量要求．
- 曾世涌简思美谢盼盼杨梅
- 关键词：双抗体夹心法
- 苏云金芽胞杆菌中aiiA基因密码子偏好性分析被引量：6
- 2013年
- aiiA基因指导表达的AiiA蛋白是一类能水解细菌群体感应信号分子内酯键的内酯酶。本研究使用CodonW、CUSP和CHIPS等相关程序对苏云金芽胞杆菌中aiiA基因的密码子使用情况进行分析,比较了aiiA基因与大肠杆菌、苏云金芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌以及毕赤酵母的密码子偏好性。结果表明,aiiA基因偏好使用以A、T结尾的密码子;aiiA基因的密码子用法与大肠杆菌、苏云金芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和毕赤酵母的基因组密码子用法都有不同程度的偏好差异,其中与毕赤酵母的密码子用法差异最大;比较了aiiA基因分别以苏云金芽胞杆菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌及毕赤酵母为宿主时密码子使用频率,发现都含有不同程度的低频密码子聚集现象,如果要在上述几种表达系统中实现aiiA基因的高效表达则需对aiiA基因的部分密码子进行优化改造。
- 曾世涌苏小惠谢盼盼毛惠民杨梅
- 关键词：苏云金芽胞杆菌AIIA基因密码子偏好性密码子优化异源表达
