国家科技支撑计划(2008BAI66B03)
- 作品数：6 被引量：11H指数：2
- 相关作者：唱韶红吴军巩新杨晓鹏刘波更多>>
- 相关机构：军事医学科学院沈阳药科大学北京天坛生物制品股份有限公司更多>>
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- 炭疽杆菌S层蛋白SLH结构域多抗的制备及其在S层蛋白表达分析中的应用
- 目的原核表达炭疽杆菌S层蛋白EA1的保守结构域SLH结构域,并制备该蛋白的多克隆抗体分析多个炭疽杆菌突变株S层蛋白表达情况。方法从炭疽杆菌A16R中经PCR扩增得到S层蛋白EA1的保守结构域SLH结构域编码序列,将其克隆...
- 陶好霞王艳春袁盛凌王芃王令春张兆山刘纯杰
- 关键词：炭疽杆菌原核表达多克隆抗体
- 文献传递
- Man_5GlcNAc_2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建被引量：8
- 2011年
- 蛋白的糖基化对蛋白的活性、高级结构及功能都有重要的影响。酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白,而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化,获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基础上,通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白,并通过DSA-FACE(基于DNA测序仪的荧光辅助糖电泳)分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基结构,发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时,毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。
- 杨晓鹏刘波宋淼巩新唱韶红薛奎晶吴军
- 关键词：糖基化毕赤酵母
- 表达乙型肝炎表面抗原重组汉逊酵母细胞破碎方法的比较被引量：2
- 2012年
- 目的比较球磨法、低温超高压破碎法和Yeast Buster酵母细胞裂解液法破碎表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)细胞的效果。方法分别采用球磨法、低温超高压破碎法和细胞裂解液法破碎表达HBsAg的重组HP细胞和重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiea,SC)细胞,测定其细胞破碎率、细胞破碎后蛋白和HBsAg释出量,比较3种方法破碎细胞的效果。结果球磨法使球磨罐和磨球中少量杂质渗入样品,其中氧化锆罐-氧化锆珠组合破碎重组HP细胞形成的杂质较少,破碎率约为60%,氧化锆罐-玻璃珠组合破碎重组HP细胞后蛋白浓度最高达2.71 mg/ml,HBsAg释出量最高为180.04μg/ml;低温超高压破碎法破碎重组HP细胞破碎率最高为71.18%,细胞破碎后蛋白浓度最高可达6.72 mg/ml,HBsAg释出量最高为350.63μg/ml;细胞裂解液法破碎细胞平均破碎率为60.30%,破碎不同次数的蛋白浓度及HBsAg释出量差异较大。结论低温超高压破碎法更适合破碎表达HBsAg的重组HP细胞。
- 王曦李彩梅劳文燕许宁刘英微张德有马锐杨旭琴朱亭玉李津
- 关键词：球磨
- 炭疽芽胞杆菌BslA_((260-652))蛋白的表达纯化与黏附功能鉴定被引量：1
- 2012年
- 【目的】克隆表达炭疽芽胞杆菌BlsA的功能区片段并对其生物学功能进行鉴定。【方法】以炭疽芽胞杆菌A16R基因组DNA为模板PCR扩增bslA(260-652)基因片段,克隆至pET-28a(+)载体。将成功构建的重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,诱导表达后收集菌体经超声破碎后,对可溶表达部分用镍柱进行亲和层析纯化。以纯化后的蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠制备该蛋白的多抗,用ELISA和Western blot检测抗血清;使用间接免疫荧光实验和细菌黏附实验研究目标蛋白及其抗体的生物学功能。【结果】BslA(260-652)获得了可溶性表达,纯化后纯度约为87.4%。以纯化蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠制备的抗血清ELISA效价可达1∶20000。将BslA(260-652)蛋白与Hela细胞共孵育后,能够直接和Hela的细胞膜结合。细菌黏附实验表明BslA(260-652)蛋白及其相应的多抗血清都能够显著地抑制炭疽芽胞杆菌A16R对Hela细胞的黏附。【结论】大肠杆菌表达得到的炭疽芽胞杆菌BslA(260-652)蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性,为深入研究BslA蛋白在炭疽芽胞杆菌致病过程中的作用奠定实验基础。
- 马坤王艳春陶好霞董杰曹诚张部昌刘纯杰
- 关键词：炭疽芽胞杆菌多克隆抗体免疫荧光
- 利用间接ELISA定量分析伤寒沙门菌表面呈现表达的流感病毒抗原
- 2011年
- 目的:建立定量检测伤寒沙门菌表面呈现表达的流感病毒抗原的间接ELISA方法。方法:ELISA板以2.5%的戊二醛溶液预处理,将呈现表达M2e等流感病毒抗原表位的伤寒沙门菌的全细胞抗原在ELISA板上进行干燥包被,通过间接ELISA确立全菌抗原的最佳包被浓度;分别采用化学合成多肽M2e和GST-M2e融合蛋白干燥包被ELISA板,绘制标准曲线,对沙门菌表面呈现表达的抗原进行定量分析;对多肽和融合蛋白干燥包被进行比较,同时确立用于定量表面展示量的回归方程。结果:用多肽包被测定的呈现表达的M2e分子数为9.8×104,以GST-M2e包被测定的呈现表达的M2e分子数为1.3×105。结论:利用全菌干燥包被ELISA板可以对伤寒沙门菌表面呈现表达的抗原进行很好的定量分析。
- 李平超王艳春陶好霞封小燕王芃袁盛凌夏焕章刘纯杰
- 关键词：流感病毒抗原伤寒沙门菌
- 人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ与IgG Fc融合蛋白在乳酸克鲁维酵母菌中的表达及产物分析
- 2011年
- 目的:在乳酸克鲁维酵母中表达人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)与IgG Fc的融合蛋白。方法:首先获得sTNFRⅡ-IgGFc融合基因片段,然后构建至乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC1中,获得sTNFRⅡ-IgGFc的表达载体,并将其电转化乳酸克鲁维酵母(Δura3),通过ELISA方法筛选高表达sTNFRⅡ-IgGFc融合蛋白的重组乳酸克鲁维酵母菌株,采用还原和非还原SDS-PAGE分析融合蛋白是否形成二聚体结构,Western印迹验证sTNFRⅡ-IgGFc融合蛋白在乳酸克鲁维酵母(Δura3)中的表达。结果:构建了sTNFRⅡ-IgGFc表达载体pKLAC1-sTNFRⅡ-IgGFc,获得了表达sTNFRⅡ-IgGFc的乳酸克鲁维酵母菌株,SDS-PAGE和Western印迹表明该融合蛋白能自发形成类似于抗体的二聚体结构。结论:实现了sTNFRⅡ-IgGFc融合蛋白在乳酸克鲁维酵母(Δura3)中的表达。
- 杨晓鹏刘波巩新唱韶红张义浜吴军
- 关键词：IGGFC融合蛋白乳酸克鲁维酵母
- 肺炎球菌表面蛋白A的原核表达及其作为多糖结合疫苗载体的可行性
- 2011年
- 目的原核表达肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA),并探讨其作为多糖结合疫苗候选载体的可行性。方法合成PspA基因,定向克隆至pET-30a(+)载体,构建重组表达质粒pET-30a-rPspA,转化E.coli Sta(rDE3)菌株,IPTG诱导表达。表达产物经Ni离子亲和层析纯化后,经Western blot鉴定。取破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)及纯化的rPspA,分别与A群脑膜炎球菌多糖(Group A meningococcal capsular polysaccharide,GAMP)通过溴化氰活化法进行偶联,获得rPspA-GAMP与TT-GAMP多糖蛋白结合物,对其进行纯化及检定。多糖结合物分别以滴鼻和肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,评价其诱发的体液免疫和黏膜免疫水平。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确;表达产物主要以可溶形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%,经纯化后纯度可达90%,可与His单抗特异性结合;肌肉注射途径显示,两种蛋白载体的结合物均能诱发较高水平的体液免疫,不同载体间差异无统计学意义(P>0.05);滴鼻途径显示,载体蛋白rPspA的结合物刺激产生sIgA的能力优于传统载体TT,差异有统计学意义(P<0.05)。结论原核表达并纯化了rPspA,其具有新型多糖蛋白载体的潜力,也可作为黏膜投递型多糖结合疫苗的候选载体。
- 李启明唐玉龙张学峰靳玉琴马智静张靖
- 关键词：多糖结合疫苗
