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基于重组蛋白SP41的布鲁氏菌间接ELISA检测方法的建立及初步应用被引量：6: 2010年; 对布鲁氏菌黏附素SP41蛋白进行表达、纯化,以表达重组蛋白为包被抗原,建立了检测布鲁氏菌病绵羊血清抗体的间接ELISA方法。克隆布鲁氏菌SP41基因,PRC、酶切、测序鉴定正确后,构建pET-32a(+)-SP41原核表达载体,转化表达菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达重组SP41蛋白,纯化表达产物后包被酶标反应板,方阵滴定法进行最佳血清稀释度和最侍抗原浓度的筛选,结果显示重组蛋白SP41最佳抗原包被浓度为0.6mg/L,最佳血清稀释度为1:50。交叉试验、阻断试验、重复性试验表明,该方法重复性好、特异性强。利用此方法检测217份绵羊血清样本,结果表明该方法的阳性检出率要高于虎红平板试验和试管凝集试验。; 张辉陈创夫乔军王远志曹旭东任艳; 关键词：布鲁氏菌间接ELISA

牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用被引量：4: 2010年; 以牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的保守基因5＇-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为101~106copies/μL,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.78。灵敏性比常规PCR高102倍。该方法具有良好的特异性,检测变异系数低于1%。应用本实验建立的方法检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品,阳性检出率为72%（18/25）,与病毒分离培养和电检观察相比,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。; 任艳陈创夫乔军王鹏雁盛金良王远志张沾李臻; 关键词：牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR

戊型肝炎病毒流行病学研究进展被引量：9: 2010年; 戊型肝炎(HE)是由肝炎病毒科(hepeviridae)肝炎病毒属(hepevirus)戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)所引起的一种人兽共患传染病,主要经粪—口途径传播。对食源性戊型肝炎病毒感染的预防与控制、异种器官移植及猪源细胞的使用有重要意义。作者就该病近年的流行病概况、传播途径、动物宿主及人工感染试验进行了综述。; 王永霞郝成武马勋; 关键词：戊型肝炎流行病学

结核分枝杆菌巢式PCR诊断技术的建立和初步评价: 2008年; 以结核分枝杆菌特有的插入序列IS6110设计巢式PCR引物,对痰样本结核分枝杆菌的基因组DNA进行扩增,建立了检测结核病病原的巢式PCR诊断方法,试验验证有较好的特异性和敏感性,采用此方法扩增结核分枝杆菌可以获得244 bp的目的片段,对常见病原菌金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、李氏杆菌、布鲁氏菌等以及无结核病史的痰样本检测阴性,通过扩增不同浓度梯度稀释的模拟阳性痰样本确定了其敏感性为4个拷贝/反应。对送检的41份痰样本采用本方法进行检测,阳性率为60.98%。; 刘景陈创夫张辉曹旭东任艳唐丽燕; 关键词：结核分枝杆菌巢式PCR

布鲁氏菌bp26基因的原核表达及BP26-间接ELISA方法的初步建立被引量：15: 2009年; 为了表达并纯化布鲁氏菌BP26蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。方法:从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆bp26基因,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,纯化BP26蛋白,进行SDS-PAGE、Western-blot检测,将纯化的BP26蛋白包被ELISA板,建立检测布鲁氏菌病的间接ELISA方法,用该方法检测42份绵羊血清,结果与标准试管凝集试验(SAT)进行比较。结果显示:正确表达并纯化了BP26蛋白,布鲁氏菌标准试管凝集试验检测的阳性率为30.85%(13/42);间接ELISA方法检测的阳性率为35.71%(15/42),二者阳性符合率为86.67%(13/ 15)。结论表达、纯化的BP26蛋白能够与布鲁氏菌阳性血清特异性结合,建立的ELISA方法比SAT方法更敏感。为以后M5-90疫苗株bp26基因缺失苗的应用提供配套性血清学检测奠定基础。; 唐利燕陈创夫王远志张辉张红星; 关键词：布鲁氏菌间接ELISA

布鲁氏菌M5-90疫苗株virB2基因缺失株的构建及鉴定被引量：14: 2010年; 【目的】构建布鲁氏菌M5-90疫苗株virB2基因缺失株。【方法】利用常规分子生物学技术构建自杀载体pGEM-7zf-ΔvirB2-sacB,通过同源重组的方法,将电转化后的布鲁氏菌分别经100 mg/L氨苄抗性筛选和5%蔗糖敏感性筛选,获得基因缺失株。对获得的基因缺失株进行PCR鉴定和稳定性检测。【结果】成功构建M5-90ΔvirB2基因缺失株,并且该缺失株在10代以内未发生回复突变。【结论】为研发新型布鲁氏菌弱毒基因缺失活苗奠定基础。; 李臻张红星唐利燕陈创夫王远志; 关键词：布鲁氏菌基因缺失株

牛病毒性腹泻病毒的分离、鉴定与同源性分析: 将采自新疆不同地区疑似牛病-T载体,对阳性重组质粒测序分析,结果与GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒NADL株序列同源性为82.0%～94.8%,证明所分离到的病毒为Ⅰ型BVDV。; 王大孝朱建民季新成王陆宝于学辉刘小兰牛国辉; 关键词：牛病毒性腹泻病毒血清中和试验 RT-PCR 同源性分析; 文献传递

羊种布鲁菌05/43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建被引量：2: 2008年; 目的构建羊种布鲁菌05/43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库。方法培养的绵羊肺泡巨噬细胞经羊种布鲁菌05/43株侵染后,以Trizol试剂提取其总RNA,用cDNA文库构建试剂盒构建巨噬细胞的cDNA文库。随机选取cDNA文库中的18个克隆进行表达序列标签(EST)序列测定,测序结果用BlastX和BlastN软件在GenBank蛋白质库和核酸库中进行序列同源性比对。结果构建的cDNA文库的库容量为1.192×106,重组率为95.65%。18个EST测序,12个与CD抗原基因、细胞因子基因、蛋白酶基因等已知功能的基因序列相关,6个为未知功能基因的EST序列。结论成功构建了羊种布鲁菌05/43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库,这将有助于阐明该菌株的致病机制。; 王远志陈创夫曹旭东盛金良张辉任艳高剑峰王端明; 关键词：基因文库

结核杆菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用被引量：10: 2010年; 针对结核杆菌CFP10基因序列设计并合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测CFP10基因的SYBR GreenⅠreal-timePCR方法。检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.997,对初始模板的检出下限为1×101copies/μL,比常规PCR方法高100倍。表明建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于结核杆菌CFP10的病原检测及定量分析。; 孟茹陈创夫张辉乔军王正荣; 关键词：结核杆菌 SYBR

GFP-ESAT6融合蛋白表达载体的构建及表达纯化被引量：3: 2009年; 根据GenBank中发表的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以热灭活的结核杆菌H37Rv菌悬液为模板,用PCR方法扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM-T载体中,成功构建克隆载体pGM-T-ESAT6。分别将pET28a-GFP质粒和pGM-T-ESAT6质粒用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,并将纯化的ESAT6基因亚克隆至pET28a-GFP中,构建原核表达载体pET28a-GFP-ESAT6。将pET28a-GFP-ESAT6转化E.coliBL 21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE和Western-blot分析,可见相对分子质量约37 200的外源蛋白带,表明GFP-ESAT6融合基因在大肠杆菌中得到了表达。用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-ESAT6融合蛋白。; 曹旭东陈创夫王远志姜文亿刘景; 关键词：结核分枝杆菌 ESAT6 GFP 原核表达

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国际科技合作与交流专项项目(2006DFA33740)

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