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绵羊乳腺特异表达hALR基因载体的构建: 2003年; 以绵羊β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)基因5'端0.8kb片段,作为目的基因人肝再生增强因子(Humanaugmenterofliverregeneration,hALR)乳腺特异表达启动子,人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus,CMV)启动子为绿色荧光蛋白基因(EnhancedGreenfluores-cenceprotein,EGFP)的启动子,构建了ALR基因乳腺特异表达而EGFP基因非组织特异性真核表达载体.这将为利用乳腺生物反应器生产人肝再生增强因子转基因动物及转基因早期胚胎鉴定奠定基础.; 马玉珍扈廷茂扈会平陈明杰苏慧敏; 关键词：绿色荧光蛋白基因 Β-乳球蛋白基因乳腺

绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究被引量：12: 2003年; 目的　用增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞 ,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响。方法　体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞 ,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞 ,G4 18筛选 10～ 12d ,挑选转基因单克隆细胞 ,传代培养 ,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析 ,并进行了培养细胞性别鉴定。结果　整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别 ,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量。结论　EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究 ,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础。; 马玉珍扈廷茂王建国扈会平刘明秋; 关键词：绵羊成纤维细胞体外培养转基因克隆细胞增强型绿色荧光蛋白

原核显微注射产生转基因绵羊胚胎被引量：3: 2007年; 体外采集绵羊卵丘卵母细胞复合体,成熟培养24 h,经过体外受精培养17 h,比较高速离心对胚胎发育的影响;高速离心可以使黑色脂滴甩到一边从而使受精卵原核清晰可见.然后将绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子和真核细胞表达增强绿色荧光蛋白(EnhancedGreen fluorescence protein,EGFP)的载体DNA显微注射于绵羊受精卵雄原核中,并将异构胚在SOF液中发育培养.结果表明:高速离心组囊胚率低于对照组,但是没有显著性差异(P>0.05);显微注射外源基因2天后在激光共聚焦显微镜下可见荧光胚胎;PCR检测5个荧光胚胎均可见特异性条带.在原核显微注射生产转基因胚胎中,绿色荧光蛋白可作为标记基因进行早期胚胎筛选,为提高转基因动物移植效率奠定实验基础.; 马玉珍扈廷茂夏国良旭日干

绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子载体的构建及表达: 2005年; 用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Humanaugmenterofliverregeneration,hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheepbeta-lactoglobulin,BLG)基因启动区序列,从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(EnhancedGreenfluorescenceprotein,EGFP)基因及其表达调控元件.由质粒p7zf(+)构建成ALR基因乳腺特异表达、EGFP基因非组织特异性表达载体.同时体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(sheepfetalfibroblastcells,SFFCs),脂质体介导载体DNA转染SFFCs,激光共聚焦显微镜观察和PCR检测转基因细胞,结果表明,增强绿色荧光蛋白基因在SFFCs中表达,转基因细胞中可扩增出BLG、ALR、EGFP基因条带.; 马玉珍张继英阿玫白雁扈廷茂; 关键词：绵羊 EGFP基因胎儿成纤维细胞转基因细胞 DNA转染脂质体介导

PJ综合症相关抑癌基因LKB1/STK11的逆转录PCR法克隆及序列分析被引量：2: 2005年; 从正常人胎盘组织中克隆出人野生型PJ综合症相关抑癌基因LKB1/STK11cDNA片段.以提取的总RNA为模板,采用逆转录法获得cDNA第一条链,采用94℃变性、72℃退火及延伸的特殊条件,经PCR扩增出抑癌基因LKB1/STK11cDNA片段,克隆到T载体,在国内首次报道了LKB1/STK11基因的克隆.序列分析表明,该cDNA全长1299bp,与GenBank中人野生型LKB1cDNA编码序列完全相同,证实获得了人野生型抑癌基因LKB1/STK11的cDNA克隆.LKB1/STK11cDNA的成功克隆为其原核表达载体的构建和LKB1/STK11蛋白在细胞内的作用及其抑癌效果、抑癌机理的研究打下了基础.; 侯鑫刘俊娥扈廷茂; 关键词：逆转录PCR CDNA克隆抑癌基因逆转录

EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达: 2006年; 从人血液中提取总DNA,利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因,将其插入表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein gene,EGFP)和人肝细胞再生增强因子(human augmenter of liver regeneration gene,ALR)融合基因表达载体pEGFP/ALR,并将其转染Hela细胞系,用含G 418的DMEM/F12培养液筛选转基因细胞,然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达,用荧光显微镜检测EGFP基因的表达.结果显示:得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体;在转基因细胞中,PCR扩增得到1.7 Kb的ALR条带,蛋白电泳得到57 KD大小条带,与ALR和EGFP融合蛋白大小相符;荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞.在转基因细胞中,EGFP和ALR同时存在并表达,绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达,从而简化了目的基因繁琐的检测手段.; 马玉珍石玉涛白雁张继英阿荣李玲; 关键词：绿色荧光蛋白融合基因

利用SRY基因鉴定绵羊成纤维细胞性别的研究被引量：1: 2003年; SRY是哺乳动物性别决定的重要基因,利用绵羊SRY基因序列设计PCR引物,对绵羊胚胎来源的成纤维细胞提取总DNA进行PCR扩增,鉴定6个不同胚胎来源的成纤维细胞的性别.结果表明,3个有扩增带为雄性,3个无扩增带为雌性,为核移植选取雄性或雌性转基因成纤维细胞提供一项可行的方法.同时提取牛、山羊、小鼠的总DNA,利用绵羊SRY基因引物进行扩增,对SRY基因在哺乳动物中的保守性进行研究.结果表明,绵羊SRY基因保守区外的一对引物对雄性山羊、绵羊、牛及小鼠均能扩增出特异的DNA片段,说明SRY基因序列有很强的保守性.; 苏慧敏扈廷茂马玉珍陈明杰; 关键词：绵羊 PCR 成纤维细胞

Lipofectamine^TM和Fugene-6介导GFP基因转染绵羊胎儿成纤维细胞的比较研究被引量：4: 2008年; 分别用LipofectamineTM和Fegene-6介导质粒pEGFP-C1转染体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞(sheepfetal fibroblast cells,sFFCs),比较了DNA浓度、转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间对转染效率的影响,通过含G418的DMEM/F12培养液筛选得到转基因单克隆细胞。结果表明脂质体转染试剂LipofectamineTM转染效率优于Fegene-6。另外,对转基因细胞进行了染色体核型分析。结果表明,转基因细胞中二倍体核型占74.5%,与对照组比较没有显著性差异。以上研究为其他基因转染sFFCs以及利用体细胞克隆法生产转基因绵羊提供了参考依据。; 马玉珍王瑞闫真王利民刘东军夏国良; 关键词：脂质体转基因染色体

一种双顺反子真核表达载体的构建及表达: 肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)能特异性地刺激肝源细胞的增殖,并且可阻止肝纤维化的进程,在病毒性肝炎、肝硬化的临床治疗中具有重要作用。病毒性肝炎、肝硬化在我国发病率...; 马玉珍扈廷茂扈会平苏慧敏陈明杰; 文献传递

抑癌蛋白PTEN的原核表达、抑癌活性研究和抗体制备被引量：4: 2006年; PTEN是具有蛋白质和酯类双重特异性磷酸酶活性的抑癌蛋白,在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。鉴于原核表达PTEN蛋白并用于抑癌实验的研究尚未见报道,因此尝试利用大肠杆菌表达有活性的PTEN蛋白,检测其抑癌效果。利用本室克隆的PTEN基因cDNA和原核表达载体pET44a(+)分别构建带6×His和Nus标签的两种诱导型原核融合表达载体pETPTEN和pETNusPTEN,在不同的大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(简写为BL)和Rosettagami(DE3)pLysS(简写为RG)中诱导表达。SDSPAGE和Westernblot检测表明:在可溶性组分和包涵体中均含有目的蛋白,在BL中目的蛋白的表达量较高(18.7%)而在RG中可溶性蛋白的比例较高(6.6%)。经纯化和包涵体蛋白复性处理后,重组融合蛋白经Chariot转运入小鼠实体瘤及人前列腺癌DU145细胞。抑癌实验表明:与对照组相比,重组PTEN蛋白对小鼠实体瘤的生长抑制率为58.76%;对癌细胞DU145的生长抑制率可达46.16%;并可导致明显的G0G1期阻滞,其中在宿主RG中表达的重组蛋白抑癌效果明显高于BL宿主中表达的目的蛋白。证实在原核系统中表达的重组PTEN蛋白具有抑癌活性,同时制备了PTEN的高效价腹水多抗,为深入研究PTEN蛋白在癌症治疗中的应用打下了良好的基础。; 侯鑫刘俊娥扈廷茂; 关键词：PTEN 原核表达抑癌活性

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国家自然科学基金(30060059)

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