国家高技术研究发展计划(2011AA100307-04)
- 作品数：9 被引量：37H指数：3
- 相关作者：李碧春储明星邱峰龙吴文忠陈玲更多>>
- 相关机构：扬州大学中国农业科学院北京畜牧兽医研究所苏州市畜牧兽医站更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划江苏高校优势学科建设工程资助项目中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 湖羊GHR和IGF-Ⅰ基因表达的发育性变化及其与肉质性状的关联被引量：14
- 2012年
- 【目的】探讨生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)和胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-likegrowth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)基因在湖羊不同生长阶段背最长肌中表达丰度与肉质性能的相关性以及这两个基因表达水平的关联性,为湖羊肌肉生长性状的选育提供遗传学资料。【方法】利用荧光定量RT-PCR分析GHR和IGF-Ⅰ基因在湖羊早期生长背最长肌肉组织中的mRNA的发育性变化。【结果】①出生后随着月龄的增加,母羊GHR基因在背最长肌的表达趋势为:先升高后降低再升高再降低最后再升高,最后6月龄到达最高点;公羊GHR在背最长肌的表达趋势为:先升高到2月龄到达一个峰值,2月龄到4月龄为一个降低的过程,4月龄到6月龄又升高,并到达最高点;母羊IGF-Ⅰ基因在背最长肌的表达趋势为:由2日龄开始依次升高最后于6月龄到达最高点;公羊IGF-Ⅰ基因在背最长肌的表达趋势为:先升高到1月龄到达一个峰值,1月龄到3月龄为一个降低的过程,并于3月龄降至与初生接近相等的水平,此后随月龄增加逐渐升高,并于6月龄到达最高点;②GHR和IGF-Ⅰ基因在湖羊各月龄间大多存在显著或极显著差异,湖羊的公羊和母羊的GHR和IGF-Ⅰ基因的相同生长阶段的表达也大多存在显著或极显著差异;③GHR和IGF-Ⅰ基因的表达存在显著正相关(0.01
- 孙伟李达马月辉关伟军储明星丁家桐李碧春张有法陈玲吴文忠周洪
- 关键词：湖羊GHR基因基因表达肉质性状
- 绵羊催乳素受体基因外显子10多态性及其与产羔数相关分析被引量：3
- 2012年
- 采用PCR-SSCP技术检测催乳素受体(PRLR)基因外显子10在湖羊、小尾寒羊、洼地羊和阿勒泰羊中的单核苷酸多态性,研究该基因与湖羊高繁殖力的关联性。结果表明:4个绵羊品种在P2引物扩增区域均符合Hardy-Wenberg平衡,但P3引物只有阿勒泰羊符合Hardy-Wenberg平衡。P2扩增片段的不同基因型分布频率在4个品种间差异不显著(P>0.05);而除阿勒泰羊P3扩增片段的基因型分布与其余3个品种间存在极显著差异(P<0.01)外,其余各品种间基因型分布差异不显著(P>0.05)。4个绵羊品种间产羔数存在极显著差异(P<0.01),但不同基因型间产羔数差异不显著(P>0.05);湖羊不同引物不同基因型产羔数的差异亦均不显著(P>0.05)。本研究表明,PRLR基因不能作为湖羊高繁殖力的候选基因。
- 张向楠孙伟储明星张有法陈玲吴文忠周洪徐厚生
- 关键词：催乳素受体基因多态性产羔数绵羊
- 山羊iPS细胞诱导及培养体系的优化
- 2014年
- 为了高效、持续的诱导获得并培养山羊诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS),本研究从饲养层和培养液方面进行优化。将分离获得3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast,GEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×105 mL-1 MEF、1×105mL-1 GEF、5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的密度接种,以高糖DMEM+20%胎牛血清(FBS)和KnockoutDMEM+20%血清替代物(KSR)为培养液,研究不同饲养层种类和培养液对山羊iPS细胞获得和培养的影响。结果显示,山羊iPS细胞在接种密度为5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20%KSR组合的培养液,山羊iPS细胞的诱导效率以及消化传代后的克隆形成率均极显著高于其他5组(P<0.01)。对该组培养的山羊iPS细胞进行碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性;Oct4、SSEA-1、Tra-1-60、Tra-1-81免疫荧光检测呈阳性;RT-PCR检测有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog基因的表达;体外能分化形成类胚体。结果表明,将细胞接种在密度为5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20%KSR的培养液更适合山羊iPS细胞的获得和培养。本试验为山羊iPS细胞的体外研究、临床试验、动物基因组修饰和山羊胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)的建系奠定基础。
- 邱峰龙左其生李东李伟陈庭锋韦光辉李碧春
- 关键词：饲养层培养液IPS细胞山羊
- 徐淮山羊多能性转录因子mRNA制备及在成纤维细胞中的表达
- 2014年
- 【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子0ct4、Sox2、K1f4和c—Myc的CDS片段,构建pMD19-T—oct4、pMD19-T—sox2、pMD19-T—k1f4和pMD19-T—c—myc重组质粒,随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-k1f4和pcDNA3-c—myc重组质粒,通过体外转录,获得该4种多能性转录因子的mRNA,并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT—PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因编码全序列,将该4种基因分别克隆到pMD19-T载体,构建pMD19-T—oct4、pMD19-T—sox2、pMD19-T-k1f4和pMD19-T—c—myc重组质粒。然后将pcDNA3.0载体和pMD19-T重组载体双酶切后用T4连接酶连接,构建含有T7启动子的真核表达载体pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-k1f4和pcDNA3-c—myc重组质粒。各重组质粒分别用限制性内切酶XhoI、XbaI单酶切,酶切后质粒模版按照体外转录试剂盒说明体外转录获得各多能性转录因子的mRNA,并对获得的mRNA进行检测,确定其稳定性和浓度。按照脂质体(体积):mRNA(质量)为1:1的比例用脂质体2000转染。转染24 h后,利用Western blot技术、间接免疫荧光实验检测徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因的mRNA在成纤维细胞中的表达。【结果】①克隆得到的徐淮山羊0ct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因编码序列全长分别为1 083、962、1 434和1 320 bp,并经TA克隆测序验证,其CDS序列与绵羊、人、牛和猪等的序列相似性在89%以上;②体外转录获得的4种多能性转录因子的mRNA经脂质体转染徐淮山羊成纤维细胞,在成纤维细胞中均定位于细胞核;③4种多能性转录因子的mRNA在徐淮山羊成纤维细胞中表达的蛋白与预期大小一致,分别为38、34、50和48 kd。【结论】成功克隆了徐淮山羊Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因,该4种多能性转录因子的mRNA能够在徐淮山羊成纤维细胞中稳定
- 邱峰龙张亚妮倪蓉李伟陈庭锋韦光辉李碧春
- 关键词：徐淮山羊体外转录MRNA
- 过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化被引量：9
- 2013年
- 【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白(ehanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTMLTX转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1的开放阅读框(ORF)两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418(400μg.mL-1)筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。
- 李伟郑蒙蒙张亚妮朱才业邱峰龙韦光辉李碧春
- 关键词：基因克隆异位表达成肌分化
- 山羊MC4R基因cDNA的克隆和序列分析及组织表达研究被引量：8
- 2012年
- 【目的】克隆山羊黑素皮质素受体4(Melanocortin receptor 4)基因(MC4R)的cDNA编码区和部分5′、3′非编码区序列,分析其在不同组织中的表达规律。【方法】以安徽白山羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、大肠、小肠、瘤胃、子宫等组织为材料,运用同源序列克隆技术并结合RT-PCR方法,对其MC4R基因cDNA进行克隆,并对其进行了组织表达和生物信息学分析。【结果】克隆得到了山羊MC4R基因全长,包含999bp的完整CDS编码区,共编码332个氨基酸。山羊MC4R基因与绵羊同源性最高(96.9%),其次为牛(93.5%)。山羊MC4R基因在心脏、肝脏等10种组织中均有表达,其中在肾脏组织中的表达量最高,大肠和小肠组织中的表达量最低。MC4R蛋白的相对分子质量为36 444.0u,等电点(PI)为7.52,分子式为C1 664H2 619N413O454S24,含有7个跨膜结构、5个丝氨酸磷酸化位点、4个苏氨酸磷酸化位点和1个特异蛋白激酶的磷酸化位点。MC4R空间结构包括7个α螺旋和5个β折叠。【结论】MC4R基因在动物进化中比较保守,并具有相似的生物学功能。
- 张子军程箫刘洪瑜储明星任春环章孝荣
- 关键词：山羊
- 精原干细胞介导法制备转基因羊的研究进展被引量：1
- 2012年
- 精原干细胞介导法制备转基因动物是用试验导入的方法将外源基因移入动物细胞并整合到其基因组中,伴随着精原干细胞分化成精子,通过受精最终使外源基因得以表达。近年来,随着对精原干细胞研究的不断深入,人们发现其在建立转基因动物方面具有巨大的应用潜力和优势。作者从精原干细胞的生物学特性及携带外源基因的原理等方面阐述了其应用于转基因动物制备的理论机制,同时介绍了精原干细胞介导法在制备转基因动物方面,特别是转基因羊生产中的应用现状。
- 邱峰龙李碧春
- 关键词：外源基因转基因羊
- 克隆山羊成纤维细胞系的建立与生物学特性的研究被引量：2
- 2015年
- 为研究克隆黄淮白山羊耳部皮肤成纤维细胞(cGSF)的体外培养及其生物学特性。通过组织块接种培养法和胰蛋白酶消化法均可以获得原代cGSF,但在接种培养24 h后,组织块法收获的细胞贴壁率和细胞量要明显高于胰酶消化法。就生长特征而言,cGSF的生长曲线也呈现典型"S"型,到达指数增长期、平台期的时间分别为第3,6天,早于普通黄淮白山羊的皮肤成纤维细胞(GSF),后者分别为第4,8天。cGSF原代(P0)、第2代(P2)、第8代(P8)细胞的染色体数目异常率均高于相同代数的GSF。在相同转染条件下,cGSF在转染p EGFP-N1后,再经G418筛选亦可形成克隆点,扩增获得阳性细胞系。总之,源自克隆山羊的体细胞体外生长、转基因后的生物学特征有别于普通动物分离得到的细胞系。因此,利用来自克隆动物的体细胞开展研究,选择分离培养、纯化、转基因方法时需要适当调整。
- 刘通王恒李运生张运海
- 关键词：体细胞克隆山羊成纤维细胞生物学特性
- 绵羊HAS2基因遗传变异及其与产羔性状关联性分析
- 2012年
- 利用PCR-SSCP和DNA测序法,首次检测了湖羊、小尾寒羊、洼地绵羊、阿勒泰羊中的HAS2基因,并对该基因第2和第3外显子部分单核苷酸多态性进行分析。结果表明:湖羊、小尾寒羊、洼地绵羊、阿勒泰羊在第2外显子中存在3种基因型,各是pp、pq、qq基因型;在第3外显子中存在2种基因型,为rr、rs基因型;HAS2基因第2外显子中发生1处C→A突变,第3外显子中发生1处A→G突变。经χ2适合性检验,4种绵羊在HAS2基因第2外显子上的基因型分布均不符合Hardy-Wenberg平衡,在第3外显子上的基因型分布全符合Hardy-Wenberg平衡。各基因型频率在4种绵羊间的分布均没有显著差异(P>0.05);湖羊2个位点上的所有基因型在产羔数上差异均不显著(P>0.05)。初步认为HAS2基因不能作为湖羊高繁殖力的候选基因。
- 孙伟张向楠洪丹丹储明星李碧春张有法陈玲吴文忠
- 关键词：产羔性状PCR-SSCP湖羊
