国家高技术研究发展计划(2008AA02Z424)
- 作品数：4 被引量：15H指数：3
- 相关作者：黄爱龙胡源张文露赵耀张秀瑜更多>>
- 相关机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划重庆市教委科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究被引量：6
- 2012年
- 目的:建立起简单、快速、灵敏、准确的慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药位点的反向线性探针(reverse lineprobe,RLP)检测方法.方法:根据HBV野生及耐药基因序列设计通用探针、3’、5’对称加有poly-C的特异性探针和5’标记生物素的扩增引物.将探针线性固定在硝酸纤维膜上,使HBV PCR扩增产物与探针进行杂交.通过优化杂交条件,建立RLP检测方法.利用该方法对重庆地区86个慢性乙肝病人进行检测,同时与直接测序结果比较.结果:半巢式PCR可对103拷贝/ml的血清样本进行有效特异扩增,新建的RLP检测方法可对PCR扩增产物在1ng/ml以上,或血清样本中突变型DNA占野生型DNA比例为5%以上的均可有效检测,86例临床的检测灵敏度为100%,野生型和耐药型的检测准确性分别为98.09%(103/105)、100%(43/43),与直接测序法比,RLP检测野生与耐药混合型准确性更好.结论:反向线性探针杂交检测方法检测HBV拉米夫定耐药位点方便、灵敏、准确,是HBV拉米夫定治疗有效的监控工具,该方法适合临床应用.
- 赖国旗张文露胡源唐红张磊谢素兰潘玥魏立雯黄爱龙
- 关键词：乙型肝炎病毒拉米夫定
- 荧光定量分型PCR、多重PCR和测序检测HBV基因型的方法学比较被引量：3
- 2010年
- 目的 比较荧光定量分型PCR、直接测序和多重PCR三种HBV基因分型法,对本实验室建立的荧光定量分型PCR方法进行评价.方法 用多重PCR、直接测序和荧光定量分型PCR法检测113份HBV DNA阳性的临床样本.结果 荧光定量分型PCR和直接测序法检出率100%,多重PCR法检出率94.69%,6份样本未能分型.荧光定量分型PCR和多重PCR的Kappa系数0.915,荧光定量分型PCR和直接测序法的Kappa系数0.742,一致性均较好.对B/C基因型混合感染样本,荧光定量分型PCR法检出28例（24.78%）,多重PCR法检出19例（16.81%）,直接测序法检出13例（11.50%）.结论 荧光定量分型PCR分型结果准确可靠,对基因型混合感染样本的检出率明显高于多重PCR及直接测序法,是一种高效、简便、快速、准确的HBV基因分型法,适用于大规模流行病学调查.
- 张秀瑜赵耀张文露胡源袁作为黄爱龙
- 关键词：乙型肝炎病毒基因型实时荧光定量PCR测序多重PCR
- 荧光定量分型PCR检测重庆地区乙型肝炎病毒感染者HBV基因型分布特征被引量：6
- 2012年
- 目的了解重庆地区不同类型乙型肝炎病毒(HBV)感染者中HBV基因型的分布特点及其临床意义。方法应用荧光定量分型PCR(GQ-PCR)法检测207例HBV感染者的HBV基因型,并用直接测序法验证其基因分型结果的准确性。结果GQ-PCR成功分型204份临床样本,3例(1.45%)未能检出,其中,B型127例,占61.35%;C型29例,占14.01%;B/C混合型48例,占23.19%。C基因型的病毒载量明显高于B基因型及B/C混合基因型(P<0.05),B基因型与B/C混合基因型的病毒载量差异无统计学意义(P>0.05)。随机选取的90份血清样本经GQ-PCR和直接测序法检测其基因型,两种方法的检测结果一致性较好(Kappa=0.834,P<0.05)。结论重庆地区HBV感染者以B型为主要基因型,其次为B/C混合型,混合感染率高于以往研究结果。C基因型患者HBV-DNA水平高于B基因型及B/C混合基因型,可能与C基因型HBV感染导致肝脏损害较重有关。
- 张秀瑜赵耀张文露胡源黄爱龙
- 关键词：肝炎病毒乙型基因型
- 含阿德福韦酯耐药突变位点的HBV聚合酶逆转录酶区域的原核表达被引量：1
- 2011年
- 目的原核表达含阿德福韦酯(Adefovir,ADV)耐药突变位点的HBV聚合酶逆转录酶(Reverse transcriptase,RT)区域。方法以野生型HBV DNA为模板,PCR扩增HBV聚合酶RT区域,克隆至质粒pHis-SUMO上,构建重组表达质粒SUMO-RTWT,并通过定点突变构建含ADV耐药突变位点(181T/V+236T)的突变质粒SUMO-MT1和SUMO-MT2,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析,并进行表达条件的优化及HBV聚合酶RT区域的结构建模。结果重组表达质粒SUMO-RTWT、SUMO-MT1和SUMO-MT2经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为56 000,可与鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合;经表达条件优化后,3种重组质粒在大肠杆菌Roset-ta(DE3)中均获得有效稳定的表达;同源结构建模结果表明,HBV聚合酶RT区域具有典型的DNA聚合酶的结构。结论已成功构建了含ADV耐药突变位点HBV聚合酶RT区域的重组原核表达质粒,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得稳定表达的可溶性目的蛋白,为研究ADV的耐药机制奠定了基础。
- 谢素兰黄爱龙蔡雪飞胡源
- 关键词：阿德福韦酯融合蛋白原核细胞
