河南省卫生厅医学科技攻关计划项目(20060011)
- 作品数：9 被引量：20H指数：3
- 相关作者：董子明路静杨洪艳赵军黄幼田更多>>
- 相关机构：郑州大学郑州大学第三附属医院长治医学院附属和济医院更多>>
- 发文基金：河南省卫生厅医学科技攻关计划项目河南省教育厅自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 原代脐静脉内皮细胞与脐静脉内皮细胞株的生物学特性比较被引量：6
- 2008年
- 目的：建立高效脐静脉内皮细胞（human umbilicalvein endothelial cell,HUVEC）体外培养方法,与HUVEC株生物学特性进行对比研究,为组织工程及相关医学基础研究提供更好的细胞来源.方法：在新鲜脐静脉内灌注2.5g/L胰蛋白酶消化获得内皮细胞,内皮细胞培养基（endothelial cellmedium,ECM）进行培养;RPMI1640培养HUVEC株.比较两组细胞形态;免疫组化、RT-PCR检测vWF,CD144的表达;Western Blot检测两组冻存复苏后细胞vWF,CD144蛋白水平的表达.结果：原代HUVEC体外生长2~3d可铺满单层,细胞呈梭形、饱满,漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构;HU-VEC株胞质多颗粒,细胞单薄.免疫组化原代HUVEC的vWF和CD144表达明显高于HUVEC株[vWF分别为（142.7±3.3）,（113.6±0.7）;CD144分别为（118.6±0.5）,（74.2±0.4）;P〈0.01].在mRNA水平,原代HUVEC基因CD144（577bp）的表达量为HUVEC株的（3.15±0.12）倍（P〈0.05）;vWF（434bp）表达量为HUVEC株的（6.15±0.37）倍（P〈0.05）.蛋白水平冻存复苏的原代HUVEC的CD144（135ku）表达量为HUVEC株的（2.07±0.31）倍（P〈0.05）;vWF（210ku）表达量为HUVEC株的（5.38±0.23）倍（P〈0.05）.结论：脐静脉灌注胰蛋白酶消化法配合ECM培养可迅速获取大量内皮细胞,其生物学特性明显优于HUVEC株,是组织工程及相关医学基础研究更好的细胞来源.
- 路静白睿华杨洪艳黄幼田郑智敏赵继敏赵明耀董子明
- 关键词：脐静脉原代培养
- 新生小鼠肺微血管内皮细胞的培养和抗原制备被引量：2
- 2008年
- 目的:建立简单有效的新生小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)的培养和抗原制备的方法.方法:用1wk龄内BALB/c小鼠的肺组织进行PMVEC的原代培养并传代,通过倒置显微镜、免疫组织化学鉴定,并用冻融、煮沸、超声等方法比较制备抗原.结果:体外培养的新生小鼠PMVEC呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的铺路石样排列,并可见管腔形成,获得的血管内皮细胞纯度较高,第Ⅷ因子相关抗原(ⅧF-Ag)和CD31表达阳性,成功建立了PMVEC的原代培养方法.通过几种方法比较出超声破碎法制备抗原方法简单浓度高.结论:PMVEC的原代培养方法简便、可靠,保持了血管内皮细胞的结构和功能,且运用超声破碎法获得纯度较高的抗原,为进一步研究PMVEC在抗肿瘤血管治疗中奠定了基础.
- 赵军路静赵继敏杨洪艳翟景明李珊张曦董子明
- 关键词：肺微血管内皮细胞细胞培养技术抗原制备
- 小鼠Lewis肺癌模型制备方法的比较研究被引量：1
- 2008年
- 目的 探讨不同方法制备小鼠Lewis肺癌模型的可行性及相关技术的改良.方法 采用体外培养细胞法、胰酶消化法、胶原酶法和匀浆法制备的不同浓度的细胞悬液皮下注射C57BL/6小鼠,观察不同方法获得的细胞数、成瘤率、成瘤时间、肿瘤体积、离体肿瘤重量、荷瘤鼠的生活习性等,判定改良技术的可行性.结果 体外培养细胞法可以获得所需细胞,成瘤率100%.而胰酶消化法、匀浆法获得的细胞较少,而且成瘤率较低,约80%～90%和60%～75%.胶原酶法则是几种方法中获得细胞数最多的,成瘤率100%.结论 改良后的胶原酶法制备小鼠Lewis肺癌模型具有方法简便、成瘤率高、经济实惠的特点,为肿瘤的实验研究奠定了基础.
- 赵军路静杨洪艳赵继敏翟景明李珊张曦董子明
- 负载人HUVECs抗原的DC疫苗诱导小鼠对宫颈癌U14的特异性免疫反应被引量：6
- 2009年
- 目的:探讨负载人脐静脉内皮细胞(HUVEC)抗原的DC疫苗诱导小鼠对宫颈癌U14的特异性免疫反应。方法:原代培养和鉴定人HUVECs,制备抗原,负载树突状细胞(DC),免疫小鼠,免疫结束后1周小鼠皮下注射小鼠宫颈癌U14细胞,观察肿瘤生长大小、检测免疫后小鼠脾细胞体外CTL效应、表面CD3+CD8+百分率和血清抗体滴度,通过细胞免疫组化和Western blot血清特异性反应分析。结果:经免疫组化鉴定成功培养出纯度高的HUVECs,抗原负载DC并注射BALB/c小鼠后,PBS组肿瘤生长最快,DC组和HUVEC-DC组肿瘤也有生长,但生长较慢,在2周后HUVEC-DC组肿瘤消失,3周后DC组肿瘤消失。小鼠脾细胞体外CTL结果显示HUVEC-DC组有明显的特异性杀伤HUVEC的作用。CD3+CD8+百分比提示HUVEC-DC组细胞毒性T细胞比例较其他两组高。小鼠血清抗体滴度示有抗体产生,免疫组化检测示组与HUVEC有特异性抗原抗体反应,Western blot显示在相对分子质量(Mr)130000和220000处有特异性条带。结论:负载人HUVECs抗原的DC疫苗和DC疫苗对小鼠宫颈癌U14有抑制作用,HUVEC-DC疫苗诱导了小鼠的细胞和体液免疫,并诱导了针对HUVECs细胞中的某些抗原的应答,这些抗原可能是整合素αν和VEGF-R2。
- 赵军翟景明路静杨洪艳黄幼田李珊董子明张曦
- 关键词：树突状细胞小鼠宫颈癌特异性免疫反应
- 结肠癌组织微环境对树突状细胞的影响
- 2008年
- 目的探讨结肠癌组织匀浆上清液模拟肿瘤微环境对人树突状细胞（DC）分化发育的影响，以及血管内皮生长因子A（VEGF-A）在其中所起的作用。方法制备新鲜结肠癌及癌旁组织匀浆上清液。分离人外周血单个核细胞，含重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和rhIL-4的1640培养液诱导DC，第2天在此基础上设结肠癌匀浆上清组、癌旁组织匀浆上清组、VEGF-A组及正常DC组，第4天加入结肠癌细胞株SW620抗原，第6天加入脂多糖，第8天收集各组细胞。ELISA检测肿瘤组织匀浆上清液中VEGF-A含量。观察DC形态，流式细胞术检测其免疫表型，RT-PCR检测CD1a表达，CCK-8检测T细胞增殖率及杀伤率。结果结肠癌组织匀浆上清VEGF-A含量明显高于癌旁组织（P〈0．05）；与正常DC组相比，结肠癌匀浆上清组细胞形态明显受到抑制，数目减少，表面抗原表达率明显下降（P〈0．01），混合淋巴细胞反应能力及杀伤力也明显下降（P〈0．01）；而VEGF-A组细胞数目及形态与正常DC组相比无明显改变，对所检测的DC表面抗原并无明显抑制（P〉0．05），但在功能实验中它却起到了明显抑制T细胞增殖及杀伤功能的作用。结论结肠癌组织匀浆上清液所模拟的微环境对DC的诱导分化及功能有明显的抑制作用，在该过程中VEGF-A起到抑制T细胞免疫功能的作用，但该作用并非通过抑制DC共刺激分子表达而实现。
- 路静赵继敏赵军黄幼田杨洪艳秦珍珠白睿华赵明耀董子明
- 关键词：树突状细胞结肠癌血管内皮生长因子A细胞毒性T细胞
- 食管癌组织微环境对树突状细胞的影响被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨食管癌组织匀浆上清液体外模拟肿瘤微环境对人树突状细胞(DC)分化发育的影响,揭示肿瘤免疫逃逸机制,为DC疫苗的应用提供理论基础。方法:制备新鲜食管癌及癌旁组织匀浆上清液,ELISA检测其VEGF-A含量。密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,含rhGM-CSF和rhIL-4RPMI1640培养液诱导DC,第2天在继续诱导DC基础上设食管癌匀浆上清组、癌旁匀浆上清组、VEGF-A组,均隔天半量换液,第4天加入食管癌细胞株EC9706抗原,第6天加入脂多糖,第8天收集各组细胞。观察DC形态,流式细胞术(FCM)检测免疫表型,RT-PCR检测CD1a表达,CCK-8检测T细胞增殖率及杀伤率。结果:食管癌组织匀浆上清VEGF-A含量[(0.987±0.319)μg/L]明显高于癌旁[(0.152±0.105)μg/L,P<0.05];食管癌匀浆上清组细胞形态明显受到抑制,CD86分子阳性率(%)与正常DC相比由69±8降为42±11、CD1a由56±12降为27±12、CD11c由21±13降为18±13(P<0.01),CD1a基因几乎无表达,刺激T细胞增殖率(%)由112.5±7.2降为70.2±3.5(P<0.01),杀伤率(%)由62.4±0.6降为46.8±1.6(P<0.01);癌旁匀浆上清液组、VEGF-A组结果与正常DC组无统计学意义。结论:食管癌组织匀浆上清液所模拟的微环境对DC的诱导分化及其功能有明显的抑制作用,在该抑制作用中VEGF-A并不起主要作用。
- 路静刘康栋赵明耀杨洪艳黄幼田秦珍珠白睿华董子明
- 关键词：食管肿瘤树突状细胞混合淋巴细胞反应细胞毒性T细胞
- 简便高效的原代HUVECs培养被引量：4
- 2009年
- 目的建立简便高效的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）体外分离、培养、冻存方法,以获得大量HUVECs为相关医学基础研究及组织工程学提供良好细胞来源。方法新鲜脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶消化,获得HUVECs,内皮细胞培养基（ECM）进行培养。倒置显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学、RT-PCR检测VWF、CD144的表达。HUVECs加入10%甘油的冻存液,置于液氮保存4周,冻存复苏后Western blot检测VWF、CD144蛋白水平的表达。结果HUVECs体外生长2-3 d可铺满单层,细胞呈梭形,漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构;高表达VWF和CD144;冻存后复苏的细胞分裂增殖旺盛,蛋白水平高表达VWF、CD144。结论脐静脉灌注胰蛋白酶消化法配合ECM培养可获取大量高纯度的内皮细胞,可作为相关研究良好的细胞来源。
- 路静赵军杨洪艳黄幼田郑智敏赵明耀董子明
- 关键词：脐静脉内皮细胞细胞冻存
- 负载小鼠bEnd．3细胞抗原的树突状细胞诱导小鼠抗同种子宫颈癌U14细胞的免疫反应
- 2011年
- 目的 探讨负载小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3抗原的树突状细胞（DC）诱导小鼠抗同种宫颈癌U14细胞的体液和细胞免疫反应.方法 培养小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3,逆转录（RT）-PCR技术检测血管内皮细胞增殖相关抗原血管内皮生长因子受体2（VEGF-R2）和整合素αV的表达,并制备bEnd.3细胞的冻融抗原,用抗原负载DC（即bEnd.3-DC）.采用bEnd.3-DC免疫小鼠（bEnd.3-DC组）,共4次,每周1次,设DC组和磷酸盐缓冲液（PBS）组作为对照;免疫结束后1周皮下注射小鼠宫颈癌U14细胞,观察荷瘤小鼠的肿瘤生长情况,检测免疫后小鼠脾T淋巴细胞体外靶向血管内皮细胞的细胞毒T淋巴细胞（CTL）效应、脾CD＋3 CD＋8T淋巴细胞百分率和免疫后小鼠血清的抗体滴度,通过免疫细胞化学方法和蛋白印迹法进行小鼠抗血清的特异性免疫反应分析.结果 经RT-PCR技术证实,bEnd.3细胞在mRNA水平表达VEGF-R2和整合素αV.PBS组小鼠的肿瘤生长最快,DC组和bEnd.3-DC组小鼠肿瘤也有生长,但生长较慢;在免疫小鼠2周后,bEnd.3-DC组小鼠肿瘤消失,PBS组小鼠肿瘤体积为（3.38 ±0.34）cm3,DC组小鼠肿瘤体积为（0.11±0.13）cm3.小鼠脾T淋巴细胞体外CTL实验结果显示,bEnd.3-DC组有明显的特异性靶向杀伤bEnd.3细胞的作用,其杀伤率超过60%.脾CD＋3 CD＋8 T淋巴细胞的百分率,PBS组为（30.0±0.9）%,DC组为（32.8±0.4）%,bEnd.3-DC组为（38.6 ±0.7）%,3组间比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.bEnd.3-DC组免疫小鼠血清的抗体滴度为1∶3200,DC组为1∶800,PBS组则为0.免疫细胞化学检测显示,bEnd.3-DC组的抗血清与bEnd.3细胞有特异性的抗原抗体反应;蛋白印迹法结果显示,在相对分子质量为220 000处有特异性的VEGF-R2蛋白条带.结论 负载小鼠bEnd.3细胞抗原的DC对小鼠宫颈癌Ui4细胞的生长有抑制作用,其原因是诱导小鼠产生了特异性的靶向血管内皮细胞的CTL和针对bEnd.3细胞中�
- 赵军路静刘雅琴杨洪艳黄幼田赵继敏李珊翟景明赵明耀张曦董子明
- 关键词：树突细胞血管内皮生长因子受体2
