国家自然科学基金(30771598)
- 作品数：17 被引量：60H指数：6
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- 相关机构：四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川大学更多>>
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- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程医药卫生更多>>
- 鸭瘟病毒UL51基因在感染宿主细胞中的定位和转录特征
- 2010年
- 对鸭瘟病毒(DPV)UL51基因在感染宿主细胞内的定位和转录时相进行分析,为进一步研究该基因的特性和功能提供有用的试验数据和材料。构建pET32a-UL51原核表达载体,将其转化至E.coliBL21(DE3)中进行IPTG诱导表达后,用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱层析法纯化该表达产物。以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子,制备兔抗UL51多克隆抗血清,通过间接免疫荧光和RT-PCR法检测该基因在DPV感染的鸭胚成纤维细胞(DEF)内的定位和转录情况。间接免疫荧光结果显示,最早可在感染后8h的胞浆中检测到特异性荧光点,24～36h有大量绿色荧光团块聚集于近核区域,之后随着细胞病变的增强,胞浆中的绿色荧光开始减弱,且在感染晚期的胞核中也出现了少量弥散的绿色荧光。RT-PCR结果显示,DPVU L51基因从感染后4h开始转录,其后转录量不断增大,从6～48h一直保持在较高水平,之后又降低。DPVU L51蛋白主要定位于感染的宿主细胞的胞浆中特别是近核区域,与其在α-疱疹病毒中的同源物的定位结果一致;并且与其他几种α-疱疹病毒的转录情况对比后,可认为该基因是一个晚期(γ类)基因。
- 沈婵娟程安春汪铭书文明招丽婵贾仁勇徐超孙涛葛菡周登春余波陈孝跃
- 关键词：鸭瘟病毒原核表达间接免疫荧光RT-PCR
- 疱疹病毒TK基因的研究进展被引量：11
- 2008年
- 简述了疱疹病毒具有表达外源基因的优势,介绍了TK基因作为疱疹病毒化学治疗和构建疱疹病毒基因缺失疫苗的首选靶基因。从TK基因的特点、TK基因的表达调控、TK酶生化特性、TK的功能域等方面做了综合论述,并对其今后的研究和应用前景进行了讨论。
- 葛菡程安春汪铭书朱德康罗启慧贾仁勇郭宇飞陈孝跃
- 关键词：疱疹病毒胸苷激酶基因生化特性功能域
- 不同条件对鸭瘟病毒感染细胞蛋白质组二维电泳分析结果的影响被引量：1
- 2009年
- 本研究以鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞为材料,围绕影响二维电泳因素进行全面探讨,以建立和优化鸭瘟病毒感染细胞蛋白质组二维电泳模型。结果表明,样品经过冷丙酮处理,水化液DTT浓度为30 mmol/L都有利于等电聚焦;采用pH5～8 IPG窄胶条和混合两性载体电解质pH3～10/pH5～8为2/1比pH3～10 IPG宽胶条和单一两性载体电解质pH3～10分离蛋白时,各蛋白点间距较大,分辨率高,更有利于显示低丰度蛋白点;1.5 mg的蛋白上样量偏大,2～DE图像出现拖尾和水平条纹,部分相邻高丰度的蛋白重叠,且还掩盖了低丰度蛋白点。PDQuest7.40软件分析显示:17 cmpH5～8 IPG胶条电泳鸭瘟病毒感染细胞蛋白质组,银染可获得1 253个蛋白点,而考染却检测到388个蛋白点;重复试验仍获得清晰、稳定的2-DE图像,同一样本不同时期,考染可获得约348、331个蛋白点,蛋白点匹配率达88%,表明了鸭瘟病毒感染细胞蛋白质组二维电泳模型稳定、分辨率高、重复性好,为鸭瘟病毒蛋白组的进一步研究和新蛋白的发现提供了重要的研究方法。
- 贾仁勇程安春汪铭书郭宇飞徐超齐雪峰袁桂萍朱德康丁轲龚永强杨梅陈孝跃
- 关键词：蛋白质组二维电泳鸭瘟病毒成纤维细胞
- 疱疹病毒UL31基因及其编码蛋白研究进展
- 2009年
- 疱疹病毒是一类有囊膜的双链DNA病毒,基因组由长节段(L)和短节段(S)组成。UL31基因是基因组独特UL序列中的一个核心基因,具有典型的开放阅读框架,编码一种磷酸化蛋白。该蛋白与UL34蛋白相互作用,定位于细胞核边缘,与病毒核衣壳初期包膜形成有关,对病毒DNA的合成、包装和释放也有一定的作用。本文就UL31基因及编码蛋白的结构特点和基本功能等研究进展进行总结,以期为疱疹病毒UL31基因的深入研究提供指导。
- 谢伟程安春汪铭书
- 关键词：疱疹病毒
- 鸭肠炎病毒UL6基因B细胞表位的预测及其主要抗原域的原核表达被引量：10
- 2008年
- 采用DNAStar Protean程序，综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数，对鸭肠炎病毒（DEV）CHv毒株UL6基因（GenBank登录号EF055890）的氨基酸序列进行了B细胞表位预测。结果显示，UL6蛋白羧基端第Thr507～Gln515、Thr521～Met529、Asp531～Phe539、Gly544～Asn562、Thr568～Gln585、Lys592～Val604、A1a681～Ala778和Tyr780～Lys790区域内含有优势B细胞表位。以DEV CHv毒株基因组作为PCR模板，利用Oligo6．0软件设计了1对引物，整体扩增涵盖上述具有优势表位的基因片段，将其亚克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中，获得表达载体pET-32a—UL6M，再将其转化至E．coli Rosetta（DE3），经IPTG诱导，外源基因获得了良好表达。以免抗DEV多克隆血清进行Western blot分析，抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应。提示，该氨基酸片段可能含有软件预测的线性表位区。
- 孙涛程安春汪铭书郭宇飞贾仁勇沈婵娟
- 关键词：鸭肠炎病毒B细胞表位预测原核表达
- 鸭瘟病毒gC基因的克隆及其分子特性分析被引量：9
- 2008年
- 对已构建的鸭瘟病毒(DPV)DNA文库重组质粒测序后,运用ORF Finder、BLASTN等工具进行全面生物信息学分析,根据分析结果设计引物,以DPV DNA为模板进行PCR扩增和T克隆,获得完整基因,经测序和探针核酸斑点杂交进行验证。结果证实,获得的完整ORF片段(ORF1296)为DPV的gC基因(GenBank登录号EU076811),全长1 296 bp,与已报道的其他疱疹病毒gC基因具有较高的同源性,它编码432个氨基酸,蛋白分子质量为45 ku、等电点(PI)为5.292,具有疱疹病毒典型I型膜蛋白结构特征。gC基因进化树分析表明,DPV与α-疱疹病毒亚科的鸟源疱疹病毒亲缘关系最近,编码的gC蛋白多为柔性区域,富含无规卷曲,含少量α-螺旋和β-折叠,氨基酸序列的第21～24、50～58、67～70、161～171、273～281、387～393位最有可能为抗原表位。此结果为进一步开展DPV gC基因及其编码蛋白的深入研究提供了有用数据。
- 徐超李欣然信洪一练蓓程安春汪铭书朱德康贾仁勇罗启慧陈孝跃
- 关键词：鸭瘟病毒GC基因克隆分子特性
- 鸭瘟病毒VP26基因克隆和分子特性分析被引量：1
- 2009年
- 利用作者实验室已构建的DPV CHv株基因文库重组质粒的DNA测序信息,结合NCBI的ORF Finder和BLAST工具分析得到了编码该病毒VP26蛋白基因(UL35)的ORF,然后采用PCR扩增出了VP26基因并将其克隆到pMD18-T载体上,经PCR和酶切鉴定以及进一步的核酸斑点杂交试验证实该基因即为DPV的VP26基因。分子特性分析表明:该基因大小为354 bp,编码117 aa,包含1个保守结构域,为Herpes_UL35,与小衣壳蛋白家族相关并在Herpes_UL35基因编码蛋白之间高度保守,而且DPVVP26蛋白与GenBank上多种α疱疹病毒同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析表明,DPV在分类地位上归属于Alphaherpesvir-us亚科,而且有可能属于新的属。另外,亚细胞定位分析表明,VP26主要定位于细胞核中。密码子偏爱性分析结果显示,编码VP26相同氨基酸的不同密码子使用频率有较大的差异,DPV VP26与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用偏爱性差异分别有18、19和25个。上述研究结果为进一步研究DPV VP26蛋白的功能和作用机理提供分子生物学依据。
- 蔡铭升程安春汪铭书朱德康罗启慧招丽婵陈孝跃
- 关键词：鸭瘟病毒克隆分子特性
- 间接免疫荧光染色检测石蜡切片中的鸭病毒性肠炎病毒和抗原定位被引量：10
- 2008年
- 差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化鸭病毒性肠炎病毒(DEV)免疫兔制备兔抗DEV高免血清后,用DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化的兔抗DEVIgG建立了间接免疫荧光染色法(IFA)检测石蜡切片中DEV的方法。IFA的最佳条件为:石蜡切片用10mmol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液为微波修复液微波修复10min,胰酶修复20min;10%小牛血清室温封闭30min;加入1∶25的兔抗DEVIgG于4℃孵育过夜;再加入FITC标记的羊抗兔IgG于37℃孵育45min。以建立的IFA对DEV人工皮下感染死亡鸭的各组织器官进行检测,在死亡鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏中检测到DEV抗原。研究表明,IFA检测石蜡切片中的DEV具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的良好方法。
- 程安春韩晓英朱德康汪铭书袁桂萍廖永洪徐超
- 关键词：间接免疫荧光石蜡切片鸭病毒性肠炎病毒抗原定位
- 检测石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒间接原位PCR方法的建立被引量：11
- 2008年
- 【目的】建立能对石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒(DEV)核酸进行定位的原位PCR方法,为鸭病毒性肠炎(DVE)存档蜡块的回顾性诊断、致病机理研究等提供有效的实验手段。【方法】据DEV的UL30-UL31基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以DEV感染死亡鸭肝脏组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中DEV的间接原位PCR方法并应用于人工感染DEV不同时间的鸭肝脏、DVE发病鸭的存档蜡块和临床病料检测。【结果】间接原位PCR对DVE死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阳性,而鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、鸭多杀性巴氏杆菌病、鸭沙门氏菌病和鸭大肠杆菌病死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阴性;间接原位PCR对人工感染DEV后2、4、6、12、24、48和72 h不同时间的鸭肝脏检测结果均为阳性,阳性细胞有肝细胞、窦皮细胞和枯否氏细胞,阳性信号多出现于坏死细胞的碎片中或细胞坏死后形成的空泡内及空泡边缘;对存档蜡块、临床病料的检测与病毒分离鉴定吻合率为100%。【结论】本研究建立的间接原位PCR方法具有直观、敏感、特异性强的优点,在显示核酸阳性信号的同时,还能判别含有靶序列的细胞类型以及组织细胞的形态结构特征与病理变化。可用于DVE的诊断、分子流行病学调查、存档蜡块的回顾性诊断和致病机理的研究。
- 程安春廖永洪朱德康汪铭书罗启慧贾仁勇陈孝跃
- 关键词：鸭病毒性肠炎病毒原位PCR寡核苷酸探针石蜡标本
- 沙门氏菌分子检测用靶基因的研究进展
- 沙门氏菌是一种对人和动物健康危害十分严重的致病菌,传统的针对沙门氏菌的微生物学检测方法不仅步骤繁琐而且费时费力。随着生命科学的发展和实验技术的革新,一大批针对沙门氏菌的新检测方法相继诞生,其中基于沙门氏菌染色体和特定基因...
- 唐田程安春汪铭书李鑫
- 关键词：靶基因沙门氏菌
