河北省自然科学基金(C2009001087)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 柯萨奇病毒B3VP1重组腺病毒载体疫苗rAd/VP22-L-VP1的构建及表达
- 2012年
- 背景:VP22是单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type1,HSV-1)UL49基因编码的碱性蛋白质,具有蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD),能够把与之融合的蛋白或与之结合的DNA等大分子跨膜送递到邻近细胞,在基因靶向预防中表现出优势。目的:构建表达单纯疱疹病毒1型VP22与柯萨奇病毒B3主要中和抗原VP1融合蛋白的重组腺病毒载体疫苗,观察外源基因在HEK293细胞中的良好表达。方法:PCR法扩增目的基因HSV-1VP22和CVB3VP1,经Linker连接,将VP22-L-VP1插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒AdTrack-CMV/VP22-L-VP1。再将此载体与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,生成重组腺病毒质粒pAd/VP22-L-VP1,脂质体介导pAd/VP22-L-VP1转染HEK293细胞包装重组腺病毒rAd/VP22-L-VP1。HEK293细胞上进行病毒扩增和滴定并检测外源基因的表达。结果与结论:构建的重组腺病毒载体pAd/VP22-L-VP1经过第4轮扩增,其滴度达到6.77×107pfu/mL,体外感染293细胞可见VP22和VP1融合蛋白的表达。说明实验成功构建并包装重组腺病毒rAd/VP22-L-VP1。
- 李剑刘贵霞米立国蓝佳明张永红金玉怀
- 关键词：柯萨奇病毒B3基因疫苗
- 重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定
- 2011年
- 目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。
- 李小凤于花蓝佳明张永红谢立新刘云宁尹玉蕾金玉怀
- 关键词：丙型肝炎病毒E2基因腺病毒载体
