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旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsSerpin)基因的克隆及序列分析: 2014年; 为了分析旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsSerpin)的分子特征,提取了旋毛虫标准株ISS534,河南、云南、天津、西安、哈尔滨等6个猪旋毛虫分离株基因组DNA,设计引物进行PCR扩增,克隆不同虫株TsSerpin基因组的DNA序列。将PCR产物连接到pMD18-T载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对TsSerpin基因序列进行预测分析。结果显示,TsSerpin cDNA序列含有1个由1 122个核苷酸组成的开放阅读框,编码由373个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值为42.5ku,理论等电点为6.54。该蛋白的二级结构中,α螺旋占36.7%,β折叠占25.2%,其余38.1%为无规则卷曲。TsSerpin第14~373位氨基酸序列为Serpin结构域,具有Serpin的保守序列FVADHPFLFFI。线性B淋巴细胞抗原表位分析显示,TsSerpin中含有12个潜在的B细胞抗原表位。TsSerpin基因的开放阅读框对应的基因组序列包含3个外显子和2个内含子。不同旋毛虫分离株TsSerpin序列高度保守,一致性在99%以上。上述研究结果为进一步研究TsSerpin蛋白的生物学功能和研制新型抗旋毛虫疫苗奠定了基础。; 盖文燕李文卉张念章曲自刚付宝权; 关键词：旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂克隆

旋毛虫TsP53重组蛋白对小鼠的免疫保护性被引量：1: 2010年; 将旋毛虫TsP53重组蛋白以20μg/只的剂量免疫小鼠3次后攻击感染旋毛虫肌幼虫200条/只。检查小鼠肠道旋毛虫7日龄成虫数、雌虫体外产新生幼虫数和感染35d后的肌幼虫数,并计算减虫率,同时用间接ELISA检测血清中抗TsP53重组蛋白的抗体应答。结果显示,TsP53重组蛋白免疫小鼠旋毛虫7日龄成虫、雌虫产新生幼虫的减虫率分别为14.34%和16.93%,与感染对照组和佐剂对照组相比差异不显著(P>0.05);感染35d后肌幼虫减虫率为38.68%,与感染对照组和佐剂对照组相比差异显著(P<0.05)。TsP53重组蛋白免疫小鼠在首次免疫后第7天出现抗体应答,可检测到抗TsP53重组蛋白的抗体,第3次免疫后第7天达到峰值,攻击感染后略有下降,但直到试验结束时仍然维持在较高水平,TsP53重组蛋白可诱导小鼠产生部分抗旋毛虫的免疫保护性。; 王鸿盛李文卉盖文燕姚菊霞曲自刚王艳华张德林薛慧文付宝权; 关键词：旋毛虫重组蛋白免疫保护性

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆与原核表达被引量：5: 2010年; 根据GenBank中旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Tsserpin)基因序列设计1对引物,从旋毛虫肌幼虫提取总RNA,应用RT-PCR扩增获得目的基因片段,进行限制性酶切后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-Tsserpin,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,经PCR、限制性酶切分析及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,表达产物纯化后用Western-blotting鉴定Tsserpin重组蛋白的抗原性。PCR与酶切鉴定结果显示,构建的重组表达质粒pET30a-Tsserpin与预期结果一致。测序结果表明,插入片段为1122bp,编码373个氨基酸,与GenBank中旋毛虫Tsserpin基因的相似性为99%。含有pET30a-Tsserpin重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE分析结果显示,表达产物的分子质量约为48.5ku,而且主要以包涵体形式存在。Western-blot分析结果表明Tsserpin重组蛋白可以被旋毛虫感染猪阳性血清特异性识别,提示其具有良好的抗原性,可以作为猪旋毛虫病免疫诊断的候选抗原。; 盖文燕李文卉王鸿盛姚菊霞曲自刚王艳华张德林付宝权; 关键词：旋毛虫重组蛋白抗原性

旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因TsCystatin1的克隆及序列分析被引量：5: 2011年; 为了研究旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的功能,应用电子克隆的方法从GenBank EST数据库获得1个旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(TsCystatin1)的部分cDNA序列,据此设计引物,并以旋毛虫新生幼虫总RNA为模板,进行反转录及PCR,克隆到该基因的完整开放阅读框序列,利用生物信息学软件对其进行了预测分析。结果表明,TsCystatin1 cDNA序列含有一个由666个核苷酸组成的开放阅读框架,编码由221个氨基酸残基组成的多肽,蛋白分子质量理论值为24.3ku,理论等电点为4.44。TsCystatin1第1～25位氨基酸残基为信号肽序列,具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的保守序列QVVAG,其C末端具有3处N-糖基化位点以及4个链内二硫键所需的半胱氨酸残基。该蛋白的二级结构中α螺旋占18.6%,β折叠占23.5%,其余57.9%为转角。结构域分析表明,该蛋白具有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样结构域,属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2,与其他线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的同源性较高。; 姚菊霞李文卉盖文燕曲自刚谢志宙王艳华张德林付宝权; 关键词：旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂克隆

旋毛虫TsP53抗原基因的原核表达及抗原性分析被引量：3: 2010年; 应用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫总RNA中获得TsP53基因片段,限制性酶切后连接到表达质粒pET30a中,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR分析及测序鉴定后,将重组表达质粒pET30a-TsP53转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,对表达产物纯化后通过间接ELISA鉴定重组蛋白的抗原性。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET30a-TsP53,测序结果表明插入片段为1 176 bp,编码391个氨基酸残基,与旋毛虫P53抗原基因序列(U25127)有99%的同源性,开放阅读框正确。含有pET30a-TsP53重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子质量约为50 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA结果表明,重组抗原可以被旋毛虫感染不同时期的猪血清特异性识别,有望用于旋毛虫病的免疫诊断。; 王鸿盛李文卉盖文燕姚菊霞曲自刚王艳华张德林薛慧文付宝权; 关键词：旋毛虫原核表达抗原性

寄生性蠕虫丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展被引量：4: 2015年; 丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)是一种蛋白水解酶,广泛存在于生物体中。本文论述了丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类、结构、功能及在寄生性蠕虫中的研究进展。指出通过对Serpin的研究,有望使其作为寄生性蠕虫病诊断和疫苗的候选分子,为寄生性蠕虫病防治奠定基础。; 盖文燕王君玮付宝权; 关键词：丝氨酸蛋白酶抑制剂

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