国家自然科学基金(30670525)
- 作品数：21 被引量：97H指数：6
- 相关作者：刘天庆马学虎宋克东崔占峰朱艳霞更多>>
- 相关机构：大连理工大学牛津大学大连医科大学附属第二医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金大连市科学技术基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 心肌样微环境诱导脂肪干细胞分化的研究被引量：6
- 2009年
- 微环境在促进干细胞分化过程中起着重要的作用,研究心肌样微环境介导脂肪干细胞向心肌细胞分化有重要意义.将脂肪干细胞与心肌细胞直接或通过细胞培养小室间接共培养,检测脂肪干细胞的分化情况.对于直接共培养体系,采用绿色荧光蛋白CFSE对脂肪干细胞进行标记,然后与心肌细胞以1:5混合后进行直接共培养,2周后,通过流式细胞仪分选分化的脂肪干细胞,并检测其分化情况.检测方法包括:扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构;免疫细胞化学检测心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)、肌钙蛋白(TnⅠ)和连接蛋白(Cx43);Western blot定量分析;RT-PCR检测心脏特异性转录因子mRNA的表达.结果表明,分化的脂肪干细胞呈现心肌样超微结构,并表达心肌特异性蛋白和转录因子,并且直接共培养体系中分化的脂肪干细胞其表达率明显高于间接共培养体系中的表达率.因此,在心肌样微环境中,除了可溶性细胞因子对分化起作用以外,心肌细胞产生的机械牵拉对脂肪干细胞向心肌细胞分化也起着重要的作用.
- 朱艳霞刘天庆宋克东马学虎崔占峰
- 关键词：脂肪干细胞共培养肌钙蛋白连接蛋白
- 体外培养脂肪组织来源干细胞与胶原/壳聚糖复合支架的亲和性被引量：12
- 2007年
- 目的:制备适合脂肪组织来源的干细胞生长的支架,观察复合支架各组成的体积比率与细胞培养的亲和性。方法:实验于2006-09/2007-01在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。①实验方法:将3.55g/LⅠ型胶原和20g/L壳聚糖分别以9∶1,7∶3,5∶5,3∶7,1∶9的体积比混合冻干,碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联后再次冻干并进行分析。②实验评估:扫描电镜观察不同材料交联前后的微观结构;IPP软件分析计算支架的平均孔径;测量支架的吸水性和孔隙率;通过胶原酶检测支架的体外生物可降解性;扫描电镜和苏木精-伊红染色观察脂肪组织来源的干细胞在复合支架上的生长情况。结果:①交联前后的微观结构:冻干后的各种支架材料呈白色,表面粗糙,材料内部呈海绵状多孔隙结构,其中以胶原/壳聚糖体积比为9∶1的复合支架最为疏松,1∶9的支架最致密。扫描电镜下支架的胶原含量越高,支架内的胶原丝越多,支架的孔与孔之间相互连通构成了通孔。交联前后支架的形态结构无明显改变。②支架的平均孔径:交联后体积比为9∶1,7∶3和5∶5的复合支架孔径50～200μm,可用于细胞的三维培养。③支架的吸水性和孔隙率:体积比为5∶5的复合支架的吸水性和含水量最高,而7∶3次之;多孔支架在水中未发生明显的溶胀现象;支架的孔隙率均在90%以上。④支架的体外生物可降解性:未交联的支架随着胶原含量的减少,支架的降解速率增加。而交联后随着胶原含量的减少,降解速率减慢,交联后的复合支架降解速度较未交联慢。⑤脂肪组织来源的干细胞在复合支架上的生长情况:脂肪组织来源的干细胞在支架上培养5d后扫描电镜观察细胞在7∶3的支架上爬行生长并融合成片,苏木精-伊红染色观察支架孔内及表面出现大量的细胞团,并融合成片状,而5∶5支架上黏附生长的细胞较少。结论:�
- 朱艳霞宋克东文鹏飞刘天庆
- 关键词：胶原壳聚糖碳化二亚胺
- 人脂肪干细胞复合胶原/壳聚糖支架在生物反应器中扩增的研究被引量：3
- 2010年
- 研究表明脂肪组织是多潜能干细胞的又一新来源,脂肪组织来源的干细胞可被用于细胞治疗及组织工程。然而,传统的培养方法很难满足临床需求。为获得大量的脂肪干细胞以满足临床需求,现将脂肪干细胞接种到胶原/壳聚糖支架上,比较细胞在静态环境和在转瓶中动态扩增的情况。通过CCK-8检测细胞增殖情况;并分析葡萄糖和乳酸的代谢情况;14d后扫描电镜观察细胞在支架内的生长情况;流式细胞仪检测干细胞相关表面标记表达;RT-PCR检测干细胞相关转录因子的表达;并检测扩增后的干细胞的多向分化潜能。结果表明:在动态微环境中扩增14d后,与静态条件下相比,支架内的细胞具有更强的增殖活性和更好的多向分化潜能。所扩增的细胞能够保持原有干细胞的特性。结论:所设计的支架-转瓶培养系统是一个简便有效的扩增脂肪干细胞的方法。
- 朱艳霞刘天庆宋克东马学虎崔占峰
- 关键词：脂肪干细胞扩增转瓶
- 中空纤维膜在旋转壁式生物反应器内作为细胞载体的性能被引量：6
- 2007年
- 利用中空纤维膜作为成骨细胞的载体,在旋转壁式中空纤维膜生物反应器(Rotating wall hollow-fiber membrane bioreactor,RWHMB)内对其进行大规模扩增,并在静态环境使用中空纤维膜和在旋转壁式生物反应器(Rotating wall vessel bioreactor,RWVB)中使用微载体以相同条件对照培养。每隔12h对细胞进行取样,培养5d后对细胞进行收获。对所扩增的细胞分别进行扩增能力、扫描电镜(SEM)观察、苏木精-伊红染色、碱性磷酸酶(ALP)染色、钙化结节染色等生物学性能检测。结果显示在RWHMB内动态培养的成骨细胞生长良好,分泌大量的细胞外基质。证实RWHMB能结合RWVB和中空纤维膜的优点,较好地模拟体内环境,对所培养的细胞施加适当的流体应力刺激,促进细胞的新陈代谢和物质交换,更有利于细胞的生长及增殖。
- 宋克东刘天庆赵虎李香琴崔占峰马学虎
- 关键词：中空纤维膜微载体生物反应器成骨细胞扩增
- 成骨细胞不同体外培养方式的耗氧速率检测被引量：1
- 2008年
- 背景:近年来组织工程种子细胞结合微胶囊技术在细胞治疗、基因治疗和药物控制释放等方面的应用越来越广泛,检测成骨细胞的耗氧量和耗氧速率,可为成骨细胞在不同培养模式中的体外培养、扩增和工程化骨组织的三维构建以及以上方面的实验提供相关的理论依据。目的:实验拟对比成骨细胞在体外静态直接培养和包囊培养两种不同方式中的耗氧量和耗氧速率。设计、时间及地点:对比观察,于2007-03/09在大连理工大学精细化工国家重点实验室干细胞与组织工程研发中心完成。材料:出生二三天SD大鼠10只,SPF级,雌雄不拘;海藻酸钠溶液购自天津远航化学品有限公司。方法:无菌条件下取大鼠颅骨,剔净后剪成1mm×1mm碎组织块,经2.5g/L胰蛋白酶溶液和1g/LⅡ型胶原酶溶液分别消化后,加入含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养基,调节细胞浓度为109L-1后接种在T-25培养瓶内。取二三代细胞分别接种于培养瓶中直接静态培养和经海藻酸钙微胶囊包囊后培养。主要观察指标:倒置相差显微镜下观察成骨细胞在静态培养瓶中和包囊培养过程中的黏附、伸展、分布情况,并测定细胞生长曲线。检测成骨细胞的生物学性能及不同体外培养方式中成骨细胞消耗氧的速率。结果:①原代培养的成骨细胞为贴壁生长,形态多为梭形或多边形。经包囊培养后成骨细胞在海藻酸钙微胶珠中呈圆形,细胞分布均匀。②体外培养的成骨细胞各种生物学性能良好。③体外静态培养瓶与包囊培养效果良好,耗氧速率分别为5.56×10-6μmol/min和1.25×10-7μmol/min。结论:体外静态直接培养的耗氧量和耗氧速率高于包囊培养法,体外静态培养与包囊培养的成骨细胞各种生物学性能都良好,适于作为组织工程的种子细胞进行下一步的实验。
- 宋飞梅冠宇宋克东姜丽丽文鹏飞刘天庆马学虎崔占峰
- 关键词：骨组织工程成骨细胞耗氧速率体外培养包囊
- 气升式环流中空纤维膜生物反应器内骨髓间充质干细胞的培养与扩增被引量：5
- 2008年
- 骨髓间充质干细胞(MSCs)具有多向分化的潜能,是重要的组织工程"种子细胞"和理想的基因治疗靶细胞,但在骨髓中的含量非常少,需体外扩增才能满足临床需求。今将第四代MSCs与Ⅰ型胶原溶液混合后接种于中空纤维膜(HFMs)内,置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内1h后形成凝胶,然后将此HFMs接种至气升式环流生物反应器(ALB)内,进行MSCs的三维动态培养与扩增。实验过程中每24h取样测吸光度、计细胞数、绘制细胞生长曲线,测定细胞代谢参数,并对扩增的细胞进行流式细胞仪分析及多向诱导分化检测。结果表明:在气升式环流中空纤维膜生物反应器(ALHFMB)内,O2含量基本保持恒定;细胞代谢旺盛,MSCs扩增倍数明显增加,7d后扩增近16倍;扩增的细胞仍保持MSCs表型并具有较强的成骨、成软骨及成脂肪的多向分化能力。
- 李香琴刘天庆朱琳宋克东马学虎崔占峰
- 关键词：扩增
- 壳聚糖支架材料的制备、表面修饰及细胞粘附性能的研究被引量：14
- 2008年
- 通过冷冻干燥法进行壳聚糖(Chitosan)多孔支架材料的制备,使用I型明胶对所制得的支架材料进行表面修饰,用于生物医用可降解复合材料的仿生构建。对所制备的支架材料分别进行密度、孔隙率和降解率等物理性质测定,并使用新西兰兔来源的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)检验支架材料的细胞粘附和生物相容性能。以未经表面处理的该种材料作为对照组,对MSCs-Chitosan复合物分别进行扫描电镜和Hoechst染色等,检测MSCs(间充质干细胞)在支架材料表面的生长、粘附和分布形态。结果显示两种壳聚糖浓度制备的多孔支架材料的空隙率分别为(86.85±2.42)%和(71.50±3.29)%,孔径为90～130μm,MSCs在经明胶表面修饰的材料表面表现出良好的粘附、伸展性能。此外,本研究还对1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(1-ethyl-(3-dimethylanimopropyl)carbodiimide,EDC)交联剂对壳聚糖基支架性能的影响进行了初步研究。研究表明,通过明胶修饰构建的仿生明胶/壳聚糖人工基质材料,具有良好的生物相容性能,作为一种理想的组织工程用支架材料,适于细胞在其上的粘附与增殖。
- 文鹏飞宋克东刘天庆朱艳霞
- 关键词：壳聚糖多孔支架材料表面修饰骨髓间充质干细胞细胞粘附
- IGF-1和动态微环境对脂肪干细胞向心肌细胞分化作用的研究被引量：4
- 2009年
- 体外组织工程模型中,生物化学和机械信号对心肌再生起着很重要的促进作用,对人胰岛素样生长因子(IGF-1)和三维动态微环境对脂肪干细胞向心肌细胞分化过程中的促进作用进行了研究.带有IGF-1基因的质粒整合到胶原-壳聚糖支架中,脂肪干细胞接种到整合质粒的支架内,未整合质粒的支架作为对照组,心肌细胞培养基作为分化培养基,转瓶生物反应器提供动态微环境.经2周分化培养后,检测质粒在支架内释放及表达情况、细胞在支架内的活性以及心肌功能性蛋白和基因的表达.结果表明:动态微环境能促进质粒DNA的释放和转染;IGF-1可促进脂肪干细胞在胶原-壳聚糖支架内增殖以及向心肌细胞分化;动态微环境可加强IGF-1的促增殖分化作用.因此,IGF-1和动态微环境能独立或相互促进脂肪干细胞在胶原-壳聚糖支架内活性,动态微环境还可强化IGF-1对脂肪干细胞的促分化作用.对体外构建工程化心肌组织进行心肌再生研究有着重要的指导意义.
- 朱艳霞刘天庆宋克东马学虎崔占峰
- 关键词：脂肪干细胞IGF-1
- 同时扩增与收获脐带血来源造血干细胞及间充质干细胞的研究被引量：4
- 2010年
- 目的为利用生物反应器,实现脐带血(Umbilical cord blood,UCB)来源的造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)与间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的同时扩增与收获。方法为在不添加血清、只添加细胞因子组合(SCF15ng·mL-1,FL5ng·mL-1,TPO6ng·mL-1,IL-315ng·mL-1,G-CSF1ng·mL-1,GM-CSF5ng·mL-1)及海藻酸钙壳聚糖胶珠包被基质细胞支持的条件下,采用玻璃包被的聚苯乙烯(Glass coated styrene copolymer,GCSC)微载体与生物反应器相结合的策略,考察了UCB-HSCs与UCB-MSCs在转瓶及旋转壁式生物反应器(Rotating wall vessel bioreactor,RWVB)内的共培养。结果RWVB中的扩增效果最佳,12天内有核细胞(Nuclear cells,NCs)扩增了3.7±0.3倍;集落形成细胞(Colony-forming units in culture,CFU-Cs)扩增了5.1±1.2倍;CD34+CD45+CD105-(HSCs)细胞扩增了5.2±0.4倍;CD34-CD45-CD105+(MSCs)细胞扩增了13.9±1.2倍。培养结束后,通过自由沉降的方法分离UCB-HSCs和粘附在GCSC微载体表面的UCB-MSCs。同时,细胞多向诱导分化及免疫表型分析结果显示,粘附在GCSC微载体表面上的细胞能够向骨、软骨及脂肪细胞分化;并能够表达间质细胞相关表面标志CD13,CD44,CD73和CD105,而不表达造血细胞的相关表面标志CD34,CD45及HLA-DR,与骨髓MSCs相一致。结论为添加细胞因子、基质细胞及微载体支持的条件下,在生物反应器内能够实现UCB-HSCs和UCB-MSCs的同时扩增与收获。
- 范秀波宋克东刘天庆殷轶群郝永杰马学虎崔占峰
- 关键词：脐带血造血干细胞生物反应器扩增
- 脐带血来源间充质干细胞体外分离培养条件的优化被引量：12
- 2008年
- 脐带血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)不仅可以作为滋养层细胞支持造血干细胞在体外的大规模扩增,在造血移植过程中还能够降低并发症的发生率以及加速造血重建功能的恢复.但是,目前UCB-MSCs的原代分离培养成功率一般只有30%左右,为进一步提高该成功率,利用正交实验方法对UCB-MSCs体外培养的主要影响因素:细胞的接种密度、细胞因子的组合及用量、是否添加血清和滋养层细胞,进行逐层筛选,并对培养出的间充质干细胞进行了流式细胞分析和向成骨、软骨及脂肪方向的诱导分化检测,以期获得UCB-MSCs培养的最佳方法.实验结果表明,细胞的接种密度是UCB-MSCs培养最显著的影响因素(P<0.1),接种密度越大,MSCs越容易生长,能够培养出MSCs的几率就越大,其次为细胞因子,添加细胞因子能有效地刺激MSCs的生长.在高接种密度的基础上,添加细胞因子IL-3(15μg/L)和GM-CSF(5μg/L),可大大提高UCB-MSCs体外原代培养的成功率,从30%左右提高到90%以上.流式细胞检测结果显示,所分离培养的细胞表达间充质干细胞的抗原(CD13+、CD29+、CD44+、CD105+、CD166+),不表达造血细胞的抗原(CD34-、CD45-、HLA-DR-),并能够向成骨、软骨及脂肪方向分化,这与源于骨髓的间充质干细胞相一致.所建立的培养方法能够为UCB-MSCs的临床应用提供大量优质的种子细胞.
- 范秀波刘天庆郝永杰刘洋马学虎崔占峰
- 关键词：正交设计脐带血间充质干细胞培养条件优化细胞因子
