山东省科技攻关计划(2008GG10002007)
- 作品数：11 被引量：16H指数：3
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- 人caspase-1真核表达载体的构建及表达
- 2009年
- 目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S_1、S_2,利用重叠延伸PCR方法(SOE)获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES_2-EGFP载体,进行茵落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果从外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES_2-EGFP经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接,茵落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GeneBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES_2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES_2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。
- 李青春张素华马晓君肖伟玲梁淑娟
- 关键词：肝肿瘤真核表达载体CASPASE-1
- siRNA阻断NF-κB通路抑制HepG2细胞增殖及NK杀伤抵抗性
- 2009年
- 目的利用小干扰RNA(siRNA)阻断肝癌细胞HepG2中的NF-κB信号通路,研究其对肝癌细胞增殖活性及NK杀伤敏感性的影响。方法利用NF-κB p65 siRNA转染HepG2细胞,48h后分别进行Western blotting及ELISA检测NF-κB p65蛋白的表达;MTT法检测转染后细胞的增殖变化及对NK-92细胞杀伤敏感性的变化。结果转染NF-κB p65 siRNA后肝癌细胞中NF-κB p65蛋白表达的水平明显下降;MTT检测发现,与对照组相比,NF-κB p65 siRNA能够明显抑制HepG2细胞的增殖活性,同时使其对NK-92细胞介导的杀伤敏感性增加(P<0.05)。结论siRNA阻断NF-κB通路能够抑制肝癌细胞增殖及对NK细胞杀伤的抵抗性。
- 刘艳艳孙萍梁淑娟
- 关键词：SIRNANF-ΚB增殖
- IL-1β对Hepa1-6细胞增殖、迁移及IFN应答的影响被引量：1
- 2011年
- 目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepa1-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响。方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL-1β基因,构建肝脏特异性pLIVE-IL-1β重组表达载体。利用transIT-LT1将鉴定后的pLIVE-IL-1β转染至Hepa1-6肝癌细胞,RT-PCR及双抗体夹心ELISA法分析转染前后IL-1表达水平,MTT法分析IL-1对细胞体外增殖活性的影响;利用细胞划痕实验分析对其迁移能力的影响,并确定对IFN-α诱导的细胞增殖抑制效应的作用。结果:重组载体经限制性酶谱分析酶解出822bp的条带,其序列与GenBank登录的小鼠IL-1β基因一致;转染后的Hepa1-6细胞培养上清中IL-1β的表达明显增高,细胞体外增殖速度明显加快;给予IFN-α作用后,IL-1β的表达使细胞对干扰素的抵抗性明显增强。结论:小鼠IL-1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL-1β能够在小鼠肝癌细胞中高效表达IL-1β,并能够显著促进肿瘤的体外增殖和迁移能力,削弱IFN-α对Hepa1-6细胞的增殖抑制作用。
- 林志娟梁淑娟王焕芹李艳平肖伟玲
- 关键词：IL-1Β肝癌NK细胞促炎性细胞因子干扰素
- 小鼠分泌型IL-1β真核表达载体的构建及其表达
- 2011年
- 目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平。方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建分泌型真核表达载体pIRES2-EGFP-smIL-1β,并将其转染至Hepa1-6细胞,RT-PCR检测融合基因的表达水平,Western blot检测细胞内mIL-1β蛋白的表达,ELISA法测定培养上清及细胞裂解液中mIL-1β水平。结果:经SOE法拼接获得的融合基因与GenBank中登录的序列一致,RT-PCR检测显示该载体能够在Hepa1-6细胞中表达融合基因mRNA,细胞培养上清中mIL-1β的分泌水平明显上升,而胞质中的mIL-1β无明显变化。结论:成功地构建了经典途径分泌的mIL-1β重组表达载体,该载体可以在Hepa1-6细胞培养上清中有效分泌具有生物活性的mIL-1β。
- 肖伟玲王雪净牟东珍林志娟王焕芹梁淑娟
- 关键词：信号肽分泌表达
- 白细胞介素-1在肿瘤靶向治疗策略中的价值
- 2009年
- 白细胞介素-1(IL-1)家族成员是一类重要的促炎性细胞因子,近年研究证实,该家族的因子不仅是体内免疫调节和炎症反应的核心介质,而且在许多肿瘤形成和进展中起着重要作用,以IL-1为靶向针对其合成及信号转导途径各层次的治疗策略,如ICE抑制剂、NF-κB抑制剂、IL-1Ra等均显示了在肿瘤治疗中的价值。
- 刘艳艳梁淑娟
- 关键词：白细胞介素1肿瘤靶向治疗
- 肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制被引量：5
- 2009年
- 目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定。反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1β1组、H22/antiIL-1β2三组,RT-PCR检测IL-1β的表达水平。以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性。结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1β反义RNA的表达载体pafpIRES2-anti-IL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,转染H22细胞后细胞中IL-1β表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1β2更为显著。成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比,H22/antiIL-1β2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05)。H22/anti-IL-1β1、H22/antiIL-1β2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1β表达、上调NK细胞的杀伤活性有关。
- 刘艳艳梁淑娟王焕芹张素华肖伟玲吴慧娜
- 关键词：肝癌白细胞介素1Β反义RNANK细胞
- 宿主因素在干扰素-α耐药中的作用及机制的研究进展
- 2009年
- 摘要干扰素-α（IFN-α）具有广谱的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节作用，是临床上治疗病毒性疾病及肿瘤的首选药物，但仍有相当一部分患者未能达到满意的疗效，存在不同程度的耐药现象，严重制约了人类的生活质量。近年来，IFN—α耐药机制及其耐药机制的逆转成为国内外研究的热点之一，研究表明，宿主因素在IFN—α耐药机制中可能发挥了重要的作用，影响着IFN—α的临床疗效。
- 王焕芹梁淑娟
- 关键词：IFN-Α耐药宿主因素
- 人caspase-1基因在肝癌细胞中的表达及对IL-1β水平的影响被引量：4
- 2011年
- 目的:将人caspase-1基因真核表达载体转染肝癌细胞后观察其表达水平及对IL-1β水平的影响,为研究cas-pase-1与IL-1β的关系及其在慢性炎症与肿瘤中的作用提供依据。方法:利用阳离子聚合物(jetPEI)将pIRES2-EGFP-caspase-1重组表达载体和pIRES2-EGFP对照载体转染人肝癌细胞HepG2(HepG2/caspase-1、HepG2/mock),48小时后倒置相差荧光显微镜下观察表达情况,利用RT-PCR、Western blot方法检测两组细胞caspase-1表达水平,采用caspase-1底物显色分析研究的方法检测两组细胞中caspase-1的活性。夹心ELISA法检测细胞培养上清以及细胞裂解液中IL-1β的表达水平。结果:转染48小时后倒置相差显微镜下可见,pIRES2-EGFP-caspase-1和pIRES2-EGFP重组表达载体均能在HepG2细胞中高效表达;HepG2/caspase-1细胞中caspase-1 mRNA表达水平显著提高;经LPS刺激后,HepG2/caspase-1细胞中caspase-1总蛋白的水平明显升高;caspase-1的生物活性水平与对照组相比具有显著性差异(t=25.679,P<0.05);HepG2/caspase-1细胞培养上清中IL-1β的水平明显高于HepG2/mock组细胞(t=3.417,P<0.05),胞浆裂解液中的变化相对不显著(t=2.396,P>0.05)。结论:人caspase-1基因真核表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1能够在肝癌细胞中高效表达caspase-1,且该重组表达载体在HepG2细胞中能提高活性IL-1β的表达。
- 林志娟肖伟玲王雪净李青春梁淑娟
- 关键词：CASPASE-1肝癌细胞IL-1Β炎症
- 分泌型小鼠IL-1β表达载体促进Hepa1-6肝癌细胞的增殖和迁移被引量：2
- 2012年
- 目的:构建小鼠经典途径分泌型IL-1β真核表达载体,转染Hepa1-6细胞后,检测胞质及上清中IL-1β分泌表达水平,并考察其对肝癌细胞体外增殖活性、迁移能力的影响。方法:利用特异性上下游引物将小鼠AFP信号肽序列和小鼠IL-1β成熟蛋白编码基因进行拼接后,再与pLIVETM载体进行连接,DNA测序鉴定阳性克隆;jetPEI法将重组载体、pLIVETM空载体、pLIVE-lacZ转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6后,经β-gal染色监测转染效率;各转染组经LPS及monesin处理后双抗体夹心ELISA法分析细胞培养上清及细胞裂解液中IL-1β的表达水平;通过MTT方法分析经典途径分泌型IL-1β对细胞体外增殖活性的影响。结果:成功构建出了小鼠分泌型IL-1β真核重组表达载体pLIVE-smIL-1β;β-gal染色后,显示外源基因在3 d左右时转染效率最高;双抗体夹心ELISA法表明转染后与Hepa1-6/mock组细胞相比,Hepa1-6/smIL-1β组细胞胞质和上清中IL-1β的表达明显增高;MTT及细胞迁移实验分析证实,转染Hepa1-6/smIL-1β组细胞体外增殖速度明显加快。结论:该表达载体可以通过经典途径分泌促炎性因子IL-1β且高效表达成熟肽IL-1β,并能够显著促进肿瘤细胞的体外增殖和迁移能力。
- 田叶林志娟孙萍刘艳菲鞠吉雨梁淑娟
- 关键词：IL-1Β肝癌细胞信号肽迁移
- 干扰素作用机制及面临的问题被引量：3
- 2009年
- 干扰素（IFN）是一类多功能细胞因子，具有抗病毒、抗增殖、抗肿瘤和免疫调节等多种功能。深入了解IFN的主要分类、活化诱导与信号转导、生物学活性及IFN抵抗的产生机制，可为IFN的临床应用及解决面临的问题提供有力依据。
- 张素华梁淑娟
- 关键词：肿瘤干扰素类生物因子细胞凋亡抗药性
