国家自然科学基金(30100157)
- 作品数：9 被引量：34H指数：5
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- HBV-TR重组腺病毒载体的构建被引量：6
- 2004年
- 目的 :构建乙肝病毒靶向核糖核酸酶 (HBVtargetedribonuclease,TR)基因的重组腺病毒载体 .方法 :将HBV TR基因及其对照组基因分别克隆入质粒载体pDC31 6得到pDC31 6 /TR等穿梭质粒 ,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1 ,3Cre以磷酸钙法共转染HEK2 93细胞得到重组腺病毒Ad/TR及对照组重组病毒 ,并以空斑形成实验(PlaqueAssay)测定病毒滴度 .结果 :成功构建了HBV TR重组腺病毒载体Ad/TR及其对照组病毒并获得了高滴度的病毒颗粒 .结论 :HBV
- 赵亚宫卫东刘军李英辉丁劲薛采芳
- 关键词：肝炎病毒乙型腺病毒载体
- 乙型肝炎病毒靶向核糖核酸酶及其突变体的原核表达和活性分析
- 2008年
- 目的:研究原核表达的乙型肝炎病毒(HBV)靶向核糖核酸酶(RNase)及其突变体(点突变失去RNase活性)的活性。方法:将构建的靶向核糖核酸酶及其突变体基因克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导融合蛋白(HBV核心蛋白与人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素的融合蛋白)的表达;表达产物经包涵体纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定,将纯化的蛋白用透析方法复性;以酵母tRNA为作用底物,应用复性的蛋白进行RNase活性分析。结果:纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶及其突变体;复性的HBV靶向核糖核酸酶可以降解酵母tRNA且具有剂量依赖性,而复性后的突变的靶向核糖核酸酶体不具有RNase活性。结论:原核表达的HBV靶向核糖核酸酶具有较强的RNase活性,为探索HBV靶向核糖核酸酶抑制乙肝病毒复制的机理奠定了基础。
- 李英辉黄豫晓赵亚刘军薛采芳
- 关键词：原核表达乙型肝炎病毒
- 带有蛋白转导域的靶向核糖核酸酶对乙型肝炎病毒复制的影响被引量：1
- 2004年
- 究表达并纯化了带有蛋白转导域HIV-TAT的靶向核糖核酸酶,将其加入到2.2.15细胞的培养上清液中,观察其对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响及对细胞有无毒性,以便为靶向核糖核酸酶用于临床治疗HBV感染奠定基础.
- 刘军丁劲薛采芳李英辉宫卫东赵亚黄豫晓
- 关键词：蛋白转导乙型肝炎病毒复制重组蛋白
- 重组腺病毒介导的HBV核心蛋白和hEDN融合蛋白基因在小鼠肝脏的表达被引量：7
- 2004年
- 目的 :使HBc hEDN基因重组腺病毒载体 (AdHBc hEDN)及其对照载体AdhEDN在小鼠肝脏获得表达 .方法 :将体外扩增获得的高滴度AdHBc hEDN和AdhEDN经尾静脉注射感染小鼠 ,并用免疫组化的方法检测AdHBc hEDN和Ad hEDN在小鼠肝脏中的表达 .结果 :重组腺病毒AdHBc hEDN和AdhEDN在小鼠肝脏均获得了阳性表达 .结论 :HBc
- 赵亚刘军宫卫东李英辉丁劲薛采芳
- 关键词：重组融合蛋白质类腺病毒科
- 重组腺病毒载体介导的靶向核糖核酸酶抑制乙肝病毒的复制
- 目的:研究重组腺病毒载体介导的靶向核糖核酸酶(HBV核心蛋白与人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素的融合蛋白)对乙肝病毒复制的影响。方法:首先将已经构建好的下列基因克隆入腺病毒穿梭质粒:带有柔性连接区的靶向核糖核酸酶(TR-L)...
- 刘军宫卫东赵亚李英辉丁劲黄豫晓薛采芳
- 关键词：乙肝病毒重组腺病毒
- 文献传递
- HBV靶向核糖核酸酶基因的原核表达和纯化及多克隆抗体的制备被引量：9
- 2005年
- 目的:旨在获得HBV靶向核糖核酸酶,并制备其兔的多克隆抗体。方法:将构建好的HBV靶向核糖核酸酶基因克隆入原核表达载体pET32a(+),转化入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达并经Ni2+亲和层析纯化。通过SDS PAGE和Westernblot鉴定后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并以复性的蛋白作为抗原,用ELISA测定抗体的效价。结果:成功地纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶,获得了较高效价的抗血清。结论:获得纯化并复性的HBV靶向核糖核酸酶和多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础。
- 李英辉刘军赵亚薛采芳丁劲黄豫晓
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白原核载体的构建及表达被引量：17
- 2003年
- 目的:构建蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease,TR)融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法:将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV core protein,HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因,克隆人含PTD TAT的pTAT原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性表达。结论:Tat-乙肝病毒 靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建,为体内应用靶向核酸酶治 疗乙型肝炎奠定了基础。
- 丁劲刘军薛采芳李英辉宫卫东
- 关键词：融合蛋白原核载体
- HBV靶向核糖核酸酶及突变体的原核表达和RNase活性分析
- 目的研究原核表达的HBV靶向核糖核酸酶(HBV核心蛋白与人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素的融合蛋白)及其突变体(点突变失去核酸酶活性)的RNase活性。方法首先,将构建好的靶向核糖核酸酶(TR)及突变体(TRm)基因克隆入原...
- 李英辉刘军薛采芳丁劲赵亚黄豫晓宫卫东
- 关键词：原核表达
- 文献传递
- 靶向核糖核酸酶在体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究被引量：5
- 2003年
- 目的 观察HBV靶向核糖核酸酶 (targetedribonuclease,TR)的体外抗病毒作用。方法 将包含HBV核心蛋白 (HBVc)和人类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素 (hEDN)编码基因克隆入pcDNA3.1(- ) ,构建HBVTR重组真核表达载体p TR。构建包含HBV核心蛋白、人类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素以及突变失活的HBVTR编码基因的重组真核表达载体p HBVc、p hEDN、p TRmut (hEDN的Lys113→Arg ,失去其RNase活性 )作为对照。脂质体转染p TR、p HBVc、p hEDN、p Trmut、pcDNA3.1(- )进入 2 .2 .15细胞。转染后 ,RT PCR证实转染基因的表达 ,通过观察转染细胞的形态核MTT法检测转基因表达的细胞毒性。用固相放免法测定转染细胞培养上清HBsAg浓度。结果 转基因在2 .2 .15细胞内都有表达 ,且对细胞无毒性。与空转染组相比 ,pcDNA3.1(- ) TR转染组HBsAg含量下降 5 8% ;对照各质粒无此变化。结论 TR在体外可以抑制HBV复制 ,同时对宿主细胞无毒性。TR可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗乙肝病毒感染。
- 李英辉刘军薛采芳丁劲宫卫东赵亚
- 关键词：乙型肝炎病毒体外抗病毒作用基因转染
- 有linker插入的靶向核糖核酸酶抑制乙肝病毒复制被引量：2
- 2003年
- 目的 :构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN )与乙肝病毒核心蛋白 (HBVc)之间插入有linker(Gly4Ser) 3 的融合真核表达载体 (该融合蛋白即为靶向核糖核酸酶 ) ,以优化分子折叠 ,并将其应用于抑制HBV复制的体外研究 .方法 :以第四军医大学病原生物学教研室已构建的pcDNA3.1 (- ) /TR为基础 .首先合成linker序列 ,经过退火形成双链并克隆入 pcDNA3.1 (- ) /TR生成pcDNA3.1 (- ) /HBc linker质粒 ;随后hEDN片段经PCR扩增后克隆入 pcDNA3.1 (- ) /HBc linker质粒生成 pcDNA3.1 (- ) /TNL质粒 ,其中效应分子 (hEDN)与靶向分子 (HBVc)之间为linker序列 .应用间接免疫荧光法检测 pcDNA3.1 (- ) /TNL在细胞的表达 ,并应用放免法测定其抗HBV活性 .同时 ,应用MTT比色法检测细胞的代谢活性 .结果 :成功构建了有linker (Gly4Ser) 3 介入的hEDN和HBVc真核融合表达载体 ;并在HepG2 .2 .1 5细胞中得到有效表达 .转染质粒 pcDNA3.1(- ) /TNL与 pcDNA3.1 (- ) /TR相比可明显地降低HepG2 .2 .1 5细胞上清中HBsAg的含量 (P <0 .0 5 ) .MTT比色分析表明细胞代谢活性未受到影响 (P >0 .0 5 ) .结论
- 宫卫东刘军丁劲赵亚李英辉薛采芳
- 关键词：乙肝病毒LINKER
