国家自然科学基金(81102230)
- 作品数：14 被引量：55H指数：5
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- 沙眼衣原体pORF5稳定转染HeLa细胞后宿主蛋白转录谱分析被引量：3
- 2017年
- 目的分析沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）质粒蛋白pORF5基因对HeLa细胞蛋白质表达谱的影响，为深入研究Ct致病机制提供实验依据。方法构建pORF5基因慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293T细胞包装慢病毒颗粒，收集慢病毒后感染HeLa细胞，流式细胞术多次分选获得pORF5基因稳定转染的HeLa细胞系（pORF5-HeLa细胞系）和对照HeLa细胞系。采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术结合二维液相色谱串联质谱（2DLC-MS/MS）技术建立pORF5-HeLa细胞和对照HeLa细胞蛋白质表达谱，筛选并构建差异蛋白质表达数据库，采用qRT-PCR和Western blot方法对部分差异蛋白质进行验证。结果成功建立了稳定过表达pORF5基因的HeLa细胞系和对照细胞系；采用iTRAQ结合2D LC-MS/MS质谱技术共鉴定了314个差异表达的宿主蛋白质，其中有159个蛋白质表达上调，155个蛋白质表达下调。差异蛋白质主要涉及代谢过程、免疫应答、生物黏附等众多事件。pORF5基因转染的HeLa细胞中组蛋白H1.2C（HIST1H1C）、血红蛋白α亚基（HBA1）、帕金森蛋白（PARK7）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、HMGB2的mRNA表达水平上调，而胞内氯离通道蛋白1（CLIC1）、细胞角蛋白7（KRT7）、SFN（14-3-3σ）、周期素依赖性刺激抑制因子2A（CDKN2A）的mRNA表达水平下调，Western blot证实PARK7、HMGB1蛋白表达水平增加，这些结果均与蛋白质组学结果一致。结论成功构建了pORF5基因稳定转染HeLa细胞的差异蛋白质表达谱，发现了一组受pORF5基因调控并与细胞代谢、增殖和黏附等生物学过程相关的差异表达蛋白质。提示pORF5可能通过改变宿主蛋白质的表达，影响宿主细胞生物学行为以促进Ct的生长发育。
- 戴文婷何战胜粟盛梅周洲陈超群李忠玉
- 关键词：沙眼衣原体蛋白质组学技术差异蛋白质
- 沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活p38MAPK和NALP3信号通路调控THP-1细胞IL-1β分泌的研究被引量：3
- 2018年
- 目的研究沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5质粒蛋白诱导THP-1细胞产生IL-1β的分子机制,为阐明Ct致病机制提供实验依据。方法将原核表达重组体pGEX-6p/pORF5转化大肠埃希菌,表达并纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经蛋白酶酶切后制备不含GST标签的pORF5蛋白;用不同浓度的pORF5蛋白体外刺激THP-1细胞,ELISA测定不同时间IL-1β水平;分别用NALP3siRNA、ASC siRNA、Caspase-1抑制剂和p38抑制剂预处理THP-1细胞,再用pORF5蛋白刺激THP-1细胞24h,ELISA测定IL-1β含量,Real-time PCR测定IL-1β和NALP3炎性体mRNA的表达,Western blot分析Caspase-1的表达及p38磷酸化水平。结果 pORF5蛋白以剂量和时间依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β,24μg/ml pORF5蛋白刺激24h时IL-1β的表达水平达到峰值(495.1±55.5pg/ml);pORF5蛋白能促进THP-1细胞中NALP3炎性体mRNA的表达;NALP3-siRNA、ASC-siRNA及Caspase-1抑制剂预处理THP-1细胞后,IL-1β分泌量分别降低37.7%、71.3%和40.1%;p38抑制剂能降低NALP3炎性体mRNA及IL-1β分泌量(P<0.01),但抑制NALP3炎性体后p38磷酸化水平未受影响(P>0.05)。结论 pORF5质粒蛋白通过激活p38MAPK和NALP3信号通路共同调控IL-1β的产生和分泌。
- 刘安元李群聂倩陶立坚粟盛梅周洲李忠玉
- 关键词：沙眼衣原体IL-1Β
- 沙眼衣原体蛋白水解酶CT841在感染细胞中的定位及抗原性研究被引量：5
- 2012年
- 目的分析沙眼衣原体蛋白水解酶CT841在感染细胞中的定位并探讨其抗原性。方法利用PCR技术获得衣原体CT841基因,将基因序列克隆到载体pGEX6p,转化大肠杆菌XL1-blue,IPTG诱导表达融合蛋白GST-CT841。融合蛋白经纯化后免疫小鼠制备特异性抗体,间接免疫荧光法分析CT841在感染细胞中的分布特征;ELISA法分析CT841的抗原性。结果CT841原核表达重组体成功构建;CT841在感染细胞的表达模式与主要外膜蛋白MOMP相似,而与衣原体蛋白酶样活性因子CPAF及包涵体膜蛋白IncA的分布模式不同;CT841与衣原体感染患者、猴、鼠血清均发生强烈的免疫反应。结论沙眼衣原体蛋白酶CT841是定位于衣原体菌体上的免疫优势抗原。
- 陆春雪曾浩吴移谋彭波胡四海蔡恒玲李忠玉钟光明
- 关键词：沙眼衣原体细胞定位抗原性
- 沙眼衣原体pORF5质粒蛋白诱发小鼠生殖道免疫损伤初步研究被引量：13
- 2013年
- 目的研究沙眼衣原体（Ch／amyd／atrachomatis，ct）pORt5质粒蛋白对小鼠生殖道组织的免疫损伤作用，并初步探讨其损伤机制。方法表达纯化GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白经PreScissionProtease酶切和去内毒素处理后分别在第1、3、6天接种于BALB／c小鼠阴道后穹窿，第7天处死小鼠，分离小鼠生殖道组织，肉眼大体观察并进行炎症病理评分；ELISA方法检测血清、阴道灌洗液和小鼠脾细胞培养上清中的TNF-a、IL-1β和IL石细胞因子水平。结果pORF5蛋白接种组小鼠输卵管壶腹部与峡部出现不同程度的肿胀，周围结缔组织发生黏连，并出现了不同程度的扭曲与积水，而PBS和csr（谷胱甘肽S-转移酶）蛋白对照组输卵管组织未出现明显改变；同时生殖道组织炎症病理积分明显高于PBS对照组（P〈0．01）和GST对照组（P〈0．01）；pOaF5蛋白接种组小鼠脾细胞培养上清、阴道分泌物中TNF-a、IL-IB、Ib6水平均显著高于PBS和GST蛋白对照组（P〈0．05）；血清中TNF-a、IL-1B水平显著高于PBS和GST蛋白对照组（P〈0．01）。结论pOaF5蛋白能引起BAIB/c小鼠生殖道组织免疫损伤，该损伤机制可能与TNF-a、IL-115、IL石等炎症因子水平升高有关。
- 邓红玉李忠玉吴移谋周辉马康康陆春雪钟光明
- 关键词：沙眼衣原体免疫损伤细胞因子
- 沙眼衣原体D型生殖道感染小鼠动物模型的建立及评价被引量：4
- 2012年
- 目的建立沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis，Ct）D型感染小鼠生殖道动物模型，为研究人类生殖道ct感染的病理变化和致病机制提供实验基础。方法分离20个临床株，经阴道接种C3H／HeJ小鼠，得到清除时间明显延长的临床株（UT0603）。应用该临床株建立ctD型感染模型，免疫荧光检测阴道脱落上皮细胞中衣原体的含量；原位组织免疫荧光检测上生殖道的衣原体感染定植情况；分离生殖道组织，肉眼观察并进行病理学评分。结果ct临床株感染小鼠下生殖道其排菌量及排菌周期明显延长，可见衣原体有上行感染和定植，并能引发类似人类生殖道感染的病理变化。结论成功建立了CtD型生殖道感染动物模型。
- 陆春雪吴移谋彭波胡四海李忠玉陈丽丽钟光明
- 关键词：沙眼衣原体生殖道感染动物模型
- 沙眼衣原体pORF5质粒蛋白单克隆抗体2H4的纯化及其免疫学特性研究被引量：1
- 2011年
- 目的 纯化抗沙眼衣原体pORF5单克隆抗体2H4并鉴定其免疫学特性.方法 大量培养pORF5单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株并收集培养上清,采用G蛋白免疫亲和层析法纯化2H4单克隆抗体；酶联免疫吸附试验（ELISA）测定2H4效价及抗体亚类；Western blot鉴定其特异性；免疫荧光试验（IFA）检测2H4单克隆抗体的衣原体种属特异性.结果 纯化后2H4抗体的纯度高达93％；效价为1：1024,免疫球蛋白类型为IgG2a;2H4抗体不仅能特异性识别pORF5融合蛋白,而且能特异性识别Ct血清型A、D、L2、鼠农原体（MoPn）、鹦鹉热嗜农原体（6BC）质粒所编码的内源性pORF5蛋白,但不识别衣原体其他质粒蛋白和肺炎嗜衣原体（Cpn）.结论 获得了高纯度的能特异识别pORF5质粒蛋白的单克隆抗体,为进一步研究pORF5蛋白结构和功能以及沙眼衣原体诊断试剂盒的研制奠定了良好的基础.
- 李忠玉吴移谋黄秋林粟盛梅周洲陈超群周辉钟光明
- 关键词：沙眼衣原体单克隆抗体免疫学特性
- 沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对HeLa细胞自噬的影响被引量：5
- 2017年
- 目的探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)质粒蛋白pORF5对HeLa细胞自噬的影响,为进一步阐明Ct致病机制提供实验依据。方法 PCR扩增Ct pORF5质粒蛋白基因,克隆入PLenO-DCE慢病毒质粒,构建慢病毒重组表达载体。慢病毒重组表达载体经双酶切及测序鉴定后与辅助质粒共转染293T细胞,制备慢病毒。收集慢病毒,再感染HeLa细胞,流式细胞仪分选获得pORF5基因稳定转染细胞株(PLenO-DCE/pORF5-HeLa)。实验同时建立对照细胞株(PLenO-DCE-HeLa)。血清饥饿处理两组细胞24h,Real-time PCR和Western blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Becin1的蛋白和mRNA表达水平,计算LC3-II/LC3I比率;采用间接免疫荧光检测自噬荧光斑点。结果 PLenO-DCE/pORF5-HeLa和PLenO-DCE-HeLa细胞饥饿处理后均出现LC3红色荧光斑点,斑点数分别为(97.6±12.1)个/细胞和(34.0±2.6)个/细胞,差异有统计学意义(t=45.36;P<0.05);饥饿处理后PLenO-DCE-HeLa和PLenO-DCE/pORF5-HeLa细胞中LC3、Beclin1的mRNA表达水平均显著高于未处理组,其中PLenO-DCE/pORF5-HeLa细胞中LC3、Beclin1mRNA的表达水平较未处理组增加3.10倍(t=95.25;P<0.01)和0.85倍(t=16.56;P<0.05),较PLenO-DCE-HeLa细胞分别增加1.95倍(t=79.12;P<0.01)和1.57倍(t=23.95;P<0.05);PLenO-DCE/pORF5-HeLa经饥饿处理24h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率和Beclin1蛋白较未处理组分别增加52.17%和76.00%(t值分别是15.13,57.24;P均<0.05),较PLenO-DCE-HeLa细胞组分别增加1.05倍(t=35.21;P<0.05)和4.34倍(t=112.23;P<0.01)。结论 pORF5质粒蛋白可诱导HeLa细胞自噬,可能在Ct致病过程中发挥重要作用。
- 杨晓玉雷文波粟盛梅陈超群李忠玉
- 关键词：沙眼衣原体细胞自噬BECLIN1
- 假定蛋白CT440在沙眼衣原体感染细胞中的定位研究被引量：1
- 2012年
- 包涵体膜蛋白在沙眼衣原体致病过程中发挥重要的作用.为确定假定蛋白CT440在沙眼衣原体感染细胞中的定位及特征,本研究采用PCR方法从D型沙眼衣原体的基因组中扩增Ct440基因,克隆入pGEX-6p原核表达载体构建pGEX-6p/Ct440原核表达重组体,重组体转化到XL1-blue大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白GST-CT440.纯化后的CT440融合蛋白免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光(IFA)和Western blot测定抗体的特异性.特异性抗体用于分析CT440蛋白在衣原体感染细胞内的定位、表达时相特征及其对衣原体感染的影响.结果表明,CT440蛋白定位于沙眼衣原体包涵体膜上,为沙眼衣原体包涵体膜蛋白;该蛋白在衣原体感染12h后开始表达,直至持续到整个感染周期;转基因在胞浆表达的CT440融合蛋白不影响其后的衣原体感染.本实验为深入研究衣原体与宿主细胞间的相互作用,阐明衣原体致病机制提供了重要的实验依据.
- 李忠玉黄秋林粟盛梅周洲陈超群钟光明吴移谋
- 关键词：沙眼衣原体
- 沙眼衣原体pORF5质粒蛋白免疫优势片段的筛选与鉴定被引量：1
- 2016年
- 目的:鉴定沙眼衣原体pORF5质粒蛋白的免疫原性,并进一步筛选和确定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。方法:以沙眼衣原体D血清型DNA为模板,设计pORF5基因全长和9个不同片段特异引物进行PCR扩增,PCR产物经Bam HⅠ、NotⅠ双酶切后插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX-6p中,构建pORF5质粒蛋白不同长度片段的原核表达重组体,重组体经PCR和测序鉴定后,转化XL1 Blue大肠杆菌表达10种不同长度的GST融合蛋白;ELISA方法检测pORF5质粒蛋白的免疫原性,Western blot鉴定pORF5质粒蛋白的免疫反应性;ELISA测定10个不同片段与沙眼衣原体生殖道感染患者血清、鼠免疫血清以及抗pORF5单克隆抗体的免疫反应性,鉴定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。结果:pORF5质粒蛋白免疫原性强,能刺激机体产生高效价抗体;破坏pORF5质粒蛋白天然空间结构,其免疫反应性基本消失;在ELISA反应中,N端缺失66氨基酸的F6片段的免疫反应强度与pORF5全长基本相似,F2与F3出现较弱的免疫反应,其余片段免疫反应消失。结论:pORF5质粒蛋白为构象依赖性免疫优势抗原,其免疫优势表位和构象表位位于C端,本研究为进一步探讨pORF5质粒蛋白的生物学功能和疫苗的研制提供实验依据。
- 何战胜邹燕粟胜梅雷文波李忠玉
- 关键词：沙眼衣原体免疫原性
- 沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抑制肿瘤坏死因子α诱导HeLa细胞凋亡被引量：2
- 2017年
- 目的 探讨沙眼衣原体质粒蛋白pORF5对肿瘤坏死因子α（TNF？α）诱导HeLa细胞凋亡的影响。方法 将含pORF5基因的慢病毒重组表达载体与辅助质粒共转染293T细胞制备慢病毒，慢病毒收集浓缩后再感染HeLa细胞，流式细胞仪分选获得pORF5基因稳定转染细胞株（pORF5？HeLa），同时建立空载体转染对照细胞株（对照HeLa）。将两种细胞株分别分为两组，一组用20 μg/L TNF？α处理（处理组），一组仅用新鲜培养基培养（未处理组），作用6 h，Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率，实时 PCR检测凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl？2和Bax mRNA表达水平，Western印迹检测Bax、Bcl？2蛋白表达水平。结果 TNF？α处理细胞6 h后，Hoechst33258染色发现pORF5？HeLa和对照HeLa细胞中均可见不同程度的核固缩、碎裂，高亮蓝色凋亡小体；pORF5？HeLa细胞的凋亡率为（35.5 ± 4.5）%，对照HeLa细胞凋亡率为（63.6 ± 5.8）%，均显著高于相应未处理组［（9.5 ± 1.5）%和（7.9 ± 0.9）%，t值分别为13.53、32.36，均P 〈 0.01］。处理组pORF5？HeLa细胞中Bax和Caspase3 mRNA表达水平较处理组对照HeLa细胞分别降低72.8%和84.5%（t值分别为35.29，42.25，均P 〈 0.01），但Bcl？2 mRNA的表达水平显著高于处理组对照HeLa细胞（t = 87.12，P 〈 0.01）。处理组pORF5？HeLa细胞中Bax蛋白表达水平亦显著低于处理组对照HeLa细胞（t = 17.58，P 〈 0.01），而Bcl？2蛋白表达水平较对照HeLa细胞增加6.8倍，差异有统计学意义（t = 18.93，P 〈 0.01）。结论 pORF5可能通过增强抗凋亡蛋白Bcl？2降低促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表达，抑制TNF？α诱导的HeLa细胞凋亡。
- 杨晓玉邹燕龚思露卜继常周洲刘良专李忠玉
- 关键词：沙眼衣原体细胞凋亡肿瘤坏死因子Α半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3BCL-2相关X蛋白质
