国家自然科学基金预研项目(XJ2008342)
- 作品数：9 被引量：60H指数：5
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- GFP标记干细胞修复椎间盘退变中的示踪研究被引量：1
- 2009年
- 目的探讨绿色荧光蛋白(GFP)示踪时效及GFP标记的骨髓间充质干细胞(MSCs)在移植后参与退变修复过程中的细胞增殖情况。方法使用针吸髓核法建立兔的椎间盘退变模型,体外培养MSCs,并用含有绿色荧光蛋白标记的腺病毒载体(Adeno-XTM-GFP)转染,成为GFP标记的MSCs(GFP-MSCs),于造模2周后植入造模的椎间盘内。在移植后第2、4、6、8周用激光共聚焦显微成像技术,观察MSCs的增殖情况,对比GFP本身荧光和免疫荧光的示踪时间。结果非免疫荧光组GFP本身荧光强度能够持续到4周,后较微弱甚至难以辨别;免疫荧光组用FITC荧光二抗标记的GFP-MSCs在8周内都能够持续稳定的显现荧光,4个时间点GFP-MSCs的阳性率的可信区间分别是:2周(14.64±2.05)%;4周(21.85±2.45)%;6周(31.03±4.03)%;8周(36.37±4.42)%。结论GFP-MSCs在椎间盘微环境中能够稳定增殖。若示踪研究需要持续超过4周,则应对GFP行免疫荧光染色,可以使有效示踪时间持续至少8周。
- 严慧深吴小涛王运涛邵建树曹烨鲍军平
- 关键词：椎间盘退变干细胞移植绿色荧光蛋白
- 髓核细胞修复椎间盘退行性变的研究进展被引量：18
- 2009年
- 目的综述髓核细胞修复椎间盘退行性变的研究进展。方法查阅近年有关髓核细胞修复椎间盘退行性变的国内外相关文献,进行回顾及综合分析。结果椎间盘髓核细胞不仅是残留脊索细胞,其对于整个椎间盘功能的维持起到重要作用,生物治疗对退变椎间盘的修复一方面试图改善髓核细胞的生存微环境,另一方面通过补充髓核细胞数量,包括移植干细胞分化为类髓核细胞来缓解椎间盘退行性变。结论基于髓核细胞或干细胞来源类髓核细胞的细胞移植技术为扭转椎间盘退行性变提供了可能。
- 王锋王运涛吴小涛
- 关键词：椎间盘退行性变细胞移植髓核细胞
- 兔骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养后的营养效应和类髓核分化效应被引量：14
- 2009年
- 目的:探讨兔骨髓间充质干细胞(BMMSCs)与髓核细胞(NPCs)共培养时BMMSCs的营养效应和类髓核分化效应及其动态变化规律。方法:应用1月龄新西兰大白兔的骨髓和髓核进行BMMSCs及NPCs的分离培养与鉴定,建立3个细胞培养组,BMMSCs与NPCs共培养组(实验组),BMMSCs单独培养组和NPCs单独培养组作为对照组。在培养的不同时间点(3、6、9、12、15、18、21d)分别检测细胞培养上清液中转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板衍化生长因子(PDGF)的含量变化及BMMSCs与NPCs的增殖能力,采用RT-PCR法检测培养不同时间点BMMSCs与NPCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达变化。结果:分离培养的两种细胞经鉴定分别为BMMSCs及NPCs。从第3天开始的各个时间点,实验组上清液中TGFβ1、PDGF的含量较两对照组明显增高(P<0.05),且随时间的延长而逐渐增高,第15天达最高,TGFβ1、PDGF分别达815.81±25.69pg/ml和494.28±20.01pg/ml,此后第18d、21d逐渐下降。实验组细胞DNA含量在各个时间点上均较两对照组明显升高(P<0.05)。从第3天开始的各个时间点,实验组NPCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原mRNA的表达较对照组高(P<0.05);同时从第15天开始至第21天,实验组BMMSCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原mRNA的表达较对照组高(P<0.05)。结论:BMMSCs与NPCs共培养时BMMSCs可通过表达TGFβ1、PDGF等细胞因子发挥其营养效应,激活NPCs,促进其增殖及细胞外基质的合成;在共培养后期,BMMSCs在髓核局部微环境下,可发挥其类髓核分化效应,开始合成蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原蛋白。
- 邵建树吴小涛王运涛曹烨严慧深
- 关键词：骨髓间充质干细胞髓核细胞共培养营养效应
- 单纯Ⅱ型胶原酶消化法分离、培养人退变椎间盘髓核细胞的形态学观察被引量：14
- 2010年
- 目的:探讨单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外培养扩增人退变椎间盘髓核细胞的可行性。方法:收集20例人退变椎间盘髓核,单纯Ⅱ型胶原酶消化分离出髓核细胞并连续培养传代,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖的表达,免疫细胞化学法行Ⅱ型胶原染色,观察髓核细胞的类软骨表型表达情况。结果:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可较好的分离培养人退变椎间盘髓核细胞,20例人退变椎间盘髓核,培养成功16例;原代髓核细胞平均7d贴壁,呈类圆形或多角形,P1代髓核细胞平均12h贴壁,呈大梭形或多角形,两代细胞融合95%所需时间分别为30d和7d,差异有统计学意义(P<0.01);聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原主要表达于原代和P1代髓核细胞浆内,被甲苯胺蓝染成天蓝色,免疫细胞化学染色主要表现为黄褐色沉淀,两代间聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达无统计学差异(P>0.05)。结论:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可简化髓核细胞分离步骤,提高培养效率;传一代后髓核细胞增殖速率提高,但仍维持类软骨表型,表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。
- 王锋吴小涛王运涛邵建树张明
- 关键词：椎间盘退行性变髓核细胞甲苯胺蓝免疫细胞化学
- 骨髓间充质干细胞的体内示踪及其修复椎间盘退变的实验研究被引量：8
- 2009年
- 目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stromal cells,MSCs)的标记与体内示踪方法,及其治疗椎间盘退变的可行性。方法:取兔MSCs行体外培养,并在体外纯化扩增,用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)磁粒子标记后分别于1、3、5、7 d用MTT法检测细胞活性。将标记后的细胞植入退变的椎间盘内。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化,免疫组化法测定Ⅱ型胶原含量的变化,用MR扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪。所得数据进行统计学处理。结果:MTT法结果显示,SPIO对MSCs的生物活性无影响,MSCs能被SPIO有效标记。运用MR扫描可观察到其在体内的分布,并发现干细胞向周边发生了迁徙。8周内实验组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量高于模型组,差异有统计学意义。结论:SPIO可有效地标记MSCs并行体内活体示踪,且不影响细胞活性,是理想的示踪剂。SPIO标记后的MSCs移植能增加髓核中细胞外基质的含量,从而延缓椎间盘退变。
- 曹烨吴小涛王运涛严慧深邵建树
- 关键词：骨髓间充质干细胞超顺磁性氧化铁磁共振成像椎间盘退变
- 经表面修饰的β-TCP对BMSCs细胞增殖及分化作用的研究被引量：1
- 2009年
- 目的研究三种材料,材料一:-磷酸三钙支架(-TCP);材料二:明胶/低结晶度羟基磷灰石涂层--磷酸三钙支架(gel/lc-HA--TCP);材料三:明胶/高结晶度羟基磷灰石涂层--磷酸三钙(gel/hc-HA--TCP)。三种材料的细胞毒性及兔骨髓基质细胞(BMSCs)与材料共培养增殖的情况。方法取兔股骨骨髓腔细胞,进行贴壁培养BMSCs。在成骨诱导液中诱导BMSCs。将诱导后的BMSCs与三种支架材料在培养板内共培养1、3、5、7、9d。采用形态学观察、MTT法及ALP检测试剂盒等方法检测材料的BMSCs细胞毒性及BMSCs细胞在材料表面的增殖和分化能力。结果光镜及电镜下观察各组无显著差异。细胞毒性在0-1级。与细胞共培养,-TCP组在第7、9天与阴性对照组差异有统计学意义。ALP检测,-TCP组在第7、9天与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.05),gel/lc-HA--TCP在第9天与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.05)。结论新型明胶/高结晶度羟基磷灰石涂层--磷酸三钙支架和明胶/低结晶度羟基磷灰石涂层--磷酸三钙支架与BMSCs生物相容性好,适合作为支架材料负载BMSCs构建组织工程骨。
- 明敏吴小涛王运涛董寅生张艳孙倩
- 关键词：骨髓基质细胞羟基磷灰石表面修饰
- BMSCs-Pluronic F-127水凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究
- 2010年
- 目的:探讨兔BMSCs-Pluronic F-127凝胶复合体移植治疗椎间盘髓核缺损退变的效果,为临床应用提供实验依据。方法:6只1月龄健康新西兰白兔,雌雄不限,各取骨髓2 ml,分离培养BMSCs。取第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs),与Pluronic F-127水凝胶混匀,制备成BMSCs-Pluronic F-127水凝胶复合体。将18只新西兰大白免建立椎间盘髓核缺损退变动物模型,并随机分为3组(n=6)。正常对照组仅分离暴露椎间盘,不作任何处理;移植治疗组将25μl BMSCs-Pluronic F-127水凝胶复合体注入缺损椎间盘中心;缺损退变组仅注射入0.01 mol.L-1PBS液25μl。8周后处死动物,取出脊柱,应用MRI测量各椎间盘的信号强度和邻近椎旁肌肉的信号强度,计算信噪比;取出相应椎间盘行阿尔辛蓝过碘雪夫(AB-PAS)染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,切片行灰度值测定和分光光度计测定蛋白多糖含量。结果:3组椎间盘信噪比差异有统计学意义(P<0.05)。AB-PAS染色显示,正常对照组及移植治疗组椎间盘染色明显,椎间盘结构清晰;缺损退变组椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清。移植治疗组Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量明显高于缺损退变组(P<0.05),但与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:兔BMSCss-PluronicF-127水凝胶复合体可修复椎间盘缺损退变,本研究为临床应用可注射式组织工程髓核移植治疗椎间盘退变奠定了实验基础。
- 李果吴小涛王运涛樊守刚王锋
- 关键词：椎间盘
- 非接触共培养条件下人BMSCs对氧化应激环境中退变髓核细胞凋亡的保护研究被引量：13
- 2010年
- 目的BMSCs移植可修复椎间盘退变,但确切修复机制尚不明确。探讨非接触共培养条件下人BMSCs对氧化应激诱导退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)凋亡的保护作用,了解BMSCs移植修复椎间盘退变的可能机制。方法密度梯度离心联合贴壁法分离、培养正常人BMSCs,并鉴定CD34、CD45、CD13细胞表面分子。胶原酶消化法分离、培养人退变椎间盘NPCs,HE染色、倒置相差显微镜观察NPCs细胞形态,甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色鉴定NPCs的类软骨细胞表型。取第3代BMSCs和第1代NPCs按共培养体系不同分为4组:A组单纯NPC(s1×106个)培养,不行凋亡诱导;B组BMSCs(1×106个)与NPCs(1×106个)共培养;C组BMSCs(3×105个)与NPCs(1×106个)共培养;D组单纯NPCs(1×106个)培养,行凋亡诱导。B、C、D组分别于共培养3、7d加入0.1mmolH2O2作用20min诱导NPCs凋亡。胰蛋白酶消化收集各组NPCs,行DAPI染色观察细胞核形态,Annexin-V/碘化丙啶染色、流式细胞仪计算凋亡率,半定量RT-PCR检测Bcl-2、Bax基因转录水平,Western-blot检测Caspase-3蛋白含量。结果成功分离并培养人BMSCs和人退变椎间盘NPCs;BMSCs鉴定呈CD34-、CD45-、CD13+;第1代NPCs呈梭形或多角形,于胞质内表达Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖。DAPI染色示凋亡的NPCs可见细胞核固缩;共培养3、7d后,B组(29.26%±8.90%,18.03%±2.25%)及C组(37.10%±3.28%,13.93%±1.25%)细胞凋亡率均低于D组(54.90%±5.97%,26.97%±3.10%),高于A组(15.67%±1.74%,8.87%±0.15%),比较差异均有统计学意义(P<0.05)。半定量RT-PCR检测示B、D组髓核细胞Bcl-2的转录水平提高(P<0.05),Bax的转录水平无显著变化(P>0.05);Western blot检测示B、C组NPCs的Cas-pase-3蛋白表达量低于D组,高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论非接触共培养条件下人BMSCs可一定程度保护氧化应激诱导的退变NPCs凋亡,BMSCs共培养预处理的NPCs可能通过降低Bax/Bcl-2的转录比例来增强抗凋亡能力。
- 王锋吴小涛王运涛李果张明
- 关键词：BMSCS髓核细胞共培养椎间盘退变细胞凋亡
- 微囊化同种异体骨髓间充质干细胞移植预防兔椎间盘退变的实验研究
- 2009年
- 目的:探讨超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)磁粒子标记的微囊化同种异体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bMMSCs)移植预防椎间盘退变的可行性。方法:选用60只健康新西兰大白兔,随机平均分为A、B、C、D、E5组,每组12只。A、B、C、D组应用髓核抽吸法制作L2/3、L3/4、L4/5椎间盘退变模型,取同种异体兔bMMSCs行体外培养,并在体外纯化扩增,用SPIO标记后行微囊化,于造模手术当时植入(A组)兔手术节段椎间盘内;B组植入未微囊化bMMSCs;C组移植空微囊;D组仅制作模型,不移植;E组为正常对照组。分别于建模后2、4、6、8周时用MRI扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪,并于相应时间点处死动物后取L2/3、L3/4、L4/5髓核组织,用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化,免疫组化法测定Ⅱ型胶原含量的变化,所得数据进行统计学分析。结果:bMMSCs能被SPIO有效标记,应用MRI扫描可观察到其在体内的分布,8周时MRI图像与4周时相比,干细胞由注射部位向周边发生了迁徙。建模后2、4、6、8周各时间点,A组髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量均高于B组、C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05);B组均高于C组及D组,差异有统计学意义(P<0.05);各时间点E组与B组、C组及D组相比差异有统计学意义(P<0.05);术后6、8周时A组与E组之间差异无统计学意义(P>0.05);各时间点C组和D组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:微囊化bMMSCs移植后能恢复兔髓核中细胞外基质含量,其效果优于单纯bMMSCs移植。
- 曹烨吴小涛王运涛严慧深邵建树
- 关键词：椎间盘退变微囊化超顺磁性氧化铁同种异体移植
