国家自然科学基金(81260252)
- 作品数：5 被引量：5H指数：1
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- 细粒棘球蚴TGF-βⅡ型受体不同结构域酵母双杂交载体的构建和自激活鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的构建细粒棘球蚴转化生长因子pII型受体全长（EgTβRⅡ）、受体结合域（EgTβRⅡ-A）和激酶域（EgTβRⅡ-K）的酵母双杂交真核表达载体，检测重组融合蛋白对酵母Y2HOold菌株的毒性作用和自激活活性。方法采用Trizol法提取细粒棘球绦虫总RNA，反转录合成cDNA；PCR扩增EgTβRⅡ—A、EgTβRⅡ—K和EgTβIRⅡ基因，分别克隆入pGADT7、pGBKT7载体中，经PCR、限制性内切酶鉴定及序列测定正确后，采用PEG／I。iAc法转入酵母菌，检测重组融合蛋白对酵母菌毒性和自激活活性。结果构建EgTβRⅡ-A、EgTβR1／-K和EgTβRU的pGADT7、pGBKT7重组质粒，经双酶切和1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到长度为406bp、1023bp和1824bp的目的基因片段，与预期结果一致；重组质粒转化酵母菌后形成的菌落与对照质粒pGBKT7转化菌的菌落生长状况一致，直径1．5～2．0mm，而在SD／-Leu／X／AbA、SD／-Trp／X／AbA平板上无菌落生长。结论成功构建EgTβRⅡ-A、EgTCtRⅡ-K和EgTCtRⅡ基因的pGADT7、pGBKT7真核表达载体，其表达蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性作用和自激活活性，重组质粒载体可用于酵母双杂交系统，为鉴定EgTL3RII在TGF-β／Smad通路中的生物学功能奠定了理论基础。
- 李亮张传山杨乐王丽敏吕国栋王俊华林仁勇
- 关键词：细粒棘球蚴酵母双杂交
- 细粒棘球蚴转化生长因子βⅠ型受体胞内域原核表达载体的构建及蛋白纯化
- 2013年
- 目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)转化生长因子βⅠ型受体胞内域(transforming growth factor-βtypeⅠreceptor intracellular domain,TβRⅠ-Ⅰ)原核表达载体,诱导表达并纯化EgTβRⅠ-Ⅰ蛋白。方法采集感染Eg的羊源原头蚴,Trizol法提取原头蚴总RNA,RT-PCR扩增EgTβRⅠ-Ⅰ基因片段,克隆至原核表达载体pET28a(+),经限制性内切酶双酶切和序列鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌感受态细胞BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经镍柱亲和层析纯化蛋白,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。结果 pET28a-EgTβRⅠ-Ⅰ原核表达载体构建成功,经IPTG诱导可表达EgTβRⅠ-Ⅰ蛋白(分子质量单位为48ku),纯化后获得大量纯度较高的可溶性蛋白。结论成功构建pET28a-EgTβRⅠ-Ⅰ原核表达载体,并获得纯化的可溶性目的蛋白,为研究EgTβRⅠ-Ⅰ在Eg体内的生物学作用及其作用方式奠定了基础。
- 杨乐王丽敏张传山李亮王俊华吕国栋王慧温浩林仁勇
- 关键词：细粒棘球绦虫基因表达蛋白纯化
- 细粒棘球蚴TGF-βⅠ型受体全长和胞内域酵母双杂交载体的构建及自激活鉴定被引量：1
- 2013年
- 目的构建细粒棘球绦虫（Eg）转化生长因子I型受体（EgTβRI）全长及胞内域酵母双杂交真核表达载体，愉测重组诱饵质粒对酵母菌株的毒性作用及自激活活性。方法采用TRIzol法提取细粒棘球蚴总RNA；采用RT—PCR扩增EgTβRI全长基因及EgTβRI胞内域（EgTβRIintracellulardomain，EgTβRII）基因片段，分别构建pGBKT7-EgTβRI和pGBKT7-EgTβRI—I真核表达载体，经PCR、限制性酶切鉴定及序列测定正确后，PEG／LiAc法转化人酵母菌株，检测诱饵蛋白对酵母菌的毒性作用及其自激活活性。结果成功构建了pGBKT7-EgTβRI及pGBKT7EgTβRI—I真核表达载体，经双酶切，分别得到1662bp和1314bp目的基因片段，大小与预测值相符。两重组质粒转化Y2HGold酵母菌形成的菌落与pGBKT7质粒转化酵母菌菌落大小一致，直径为1．5～2．0mm；两重组质粒转化酵母菌在SD／Trp／X／A平板上无蓝色菌落生长，在SD／-Trp平板上形成直径为2mill的菌落。结论成功构建了pGBKT7-EgTβRI及pGBKT7-EgTβRI—I真核表达载体，其表达蛋白对Y2HGold酵母菌无毒性作刷和无自激活活性；该表达载体可以用于酵母双杂交系统，为进一步研究EgTβRI与其配体之间的交互作用奠定了基础。
- 杨乐王丽敏张传山李亮王俊华吕国栋王慧林仁勇温浩
- 关键词：细粒棘球绦虫酵母双杂交
- 细粒棘球蚴MKK1和MKK2基因原核表达载体的构建及其诱导表达被引量：1
- 2014年
- 目的分别构建细粒棘球蚴(Eg)丝裂原活化蛋白激酶激酶MKK1和MKK2基因原核表达载体,诱导表达并纯化EgMKK1和EgMKK2蛋白。方法采集绵羊肝脏感染的Eg原头蚴,Trizol法提取原头蚴总RNA,反转录PCR分别扩增EgMKK1和EgMKK2基因片段,克隆至原核表达载体pET28a(+),经限制性内切酶双酶切和测序鉴定正确后转化大肠埃希菌感受态细胞BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化蛋白,并进行SDS-PAGE分析。结果测序证明pET28a-EgMKK1和pET28a-EgMKK2原核表达载体构建正确,在37℃经IPTG(终浓度1mmol/L)诱导可表达EgMKK1和EgMKK2蛋白,分子质量单位分别为44.96ku和64.01ku,与理论值相符,且以包涵体形式存在。表达产物纯化后的可溶性蛋白EgMKK1和EgMKK2含量分别为0.64mg/ml和1.2mg/ml。结论成功构建了MKK1和MKK2基因原核表达载体,表达蛋白可用于动物免疫,为研究EgMKK1和EgMKK2在Eg体内的生物学作用奠定了基础。
- 张传山杨乐王丽敏李亮王俊华吕国栋林仁勇
- 关键词：细粒棘球绦虫基因表达蛋白纯化
- 细粒棘球蚴MAPKK样激酶及其下游成员ERK和P38酵母双杂交载体的构建与自激活鉴定被引量：2
- 2014年
- 目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus，Eg）丝裂原活化蛋白激酶激酶（EgMKK1）及其下游成员ERK、P38酵母双杂交载体，并检测融合蛋白对酵母菌生长的毒性作用及自激活活性。方法采集绵羊肝脏感染的Eg原头蚴，生理盐水冲洗5次，TRIzol法提取原头蚴总RNA，取1ugRNA反转录cDNA。以cDNA为模板，PCR分别扩增EgMKK1、EgERK和EgP38基因片段，分别经限制性内切酶EcoRI和BamHI、EcoRI和BarnHI、EcoRI和SalI双酶切，酶切片段连接至酵母双杂交载体pGADT7或pGBKT7，经酶切及测序鉴定正确后，应用PEG／I。iAc法将重组载体转化人感受态酵母菌株Y2HGold，利用固体培养基筛选，检测融合蛋白对酵母菌株生长的毒性作用及自激活活性。结果经PCR扩增，分别获得目的基因EgMKK1、EgERK和EgP38。构建的重组酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK及pGBKT7-EgP38经双酶切，分别得到1017bp、1086bp和1107bp目的基因片段，大小与预测值相符。重组酵母双杂交载体转化Y2HG01d酵母菌在SD／-Trp平板上形成直径为1．5～2．0mm的菌落，与原始载体pGADT7或pGBKT7转化酵母菌菌落大小一致；重组酵母双杂交载体转化酵母菌在SD／-Trp和SD／-Leu平板均有直径约2mm白色菌落生长，而SDO／X／A和DDO／x／A固体培养基平板上无蓝色菌落生长。结论成功构建了酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK和pGBKT7-EgP38，其表达蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性和自激活作用，为进一步研究EgMKK1与其下游成员EgERK、EgP38之间的相互作用奠定了基础。
- 张传山杨乐王丽敏李亮王俊华吕国栋林仁勇
- 关键词：细粒棘球绦虫酵母双杂交自激活
