国家自然科学基金(81071769)
- 作品数：8 被引量：14H指数：3
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- GPI修饰的ESAT-6核酸疫苗的构建及其免疫功能初探被引量：2
- 2011年
- 目的构建糖基化磷脂酰肌醇(GPI)修饰的结核杆菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)核酸疫苗,初步分析其免疫功能。方法利用重叠PCR法构建pIRES-ESAT-6-gpi重组体,转染B16F10细胞,G418筛选阳性克隆,用RT-PCR、免疫荧光检测转染细胞的ESAT-6抗原表达情况;采集ESAT-6核酸疫苗免疫鼠血清,分别检测抗体滴度和CDC效应,免疫磁珠法分选CD4+和CD8+T细胞,CFSE/7-AAD细胞毒实验分析CTL细胞毒活性。结果测序正确的重组体pIRES-ESAT-6-gpi转染细胞后,ESAT-6表达于细胞膜表面。ESAT-6核酸疫苗免疫血清和CD8+T细胞分别通过CDC效应和细胞毒作用杀伤膜表达ESAT-6的B16F10细胞。结论构建的GPI修饰的ESAT-6核酸疫苗能够诱导免疫鼠产生体液和细胞免疫反应,杀伤膜表达ESAT-6的B16F10细胞,为进一步基于该法构建B16F10瘤苗的抗肿瘤免疫效应及机制研究奠定了基础。
- 何向锋王净余方流赵枫姝张洪义陈峻崧陈登宇曹文虎窦骏
- 关键词：B16F10ESAT-6GPI核酸疫苗
- 小鼠黑色素瘤细胞系B16F10中侧群细胞的分离及其耐药性初探被引量：1
- 2011年
- 利用荧光活化细胞分选技术,我们分选小鼠黑色素瘤B16F10细胞系中的侧群细胞(SP细胞)和非侧群细胞(Non-SP细胞),用噻唑兰(MTT)法检测化疗药长春新碱对两群细胞的抑制率,计算半数抑制浓度(IC50),并通过RT-PCR和荧光定量PCR法比较两者ABCG2基因表达量。结果显示,B16F10细胞系中存在0.96%的SP细胞,化疗药长春新碱对SP细胞的IC50是1.26μg/ml,对Non-SP细胞的IC50是0.37μg/ml,两者差异有显著性意义(P<0.05)。荧光定量PCR法检测SP细胞的ABCG2分子表达量是Non-SP细胞的6.27倍。结果提示,小鼠黑色素瘤细胞系B16F10中存在SP细胞,其较Non-SP细胞显示出更强的耐药性,SP细胞较高表达ABCG2可能是其耐药机制之一。
- 文萍杨柳王净赵枫殊何君江龙委窦骏
- 关键词：B16F10ABCG2SP细胞长春新碱
- B16F10-ESAT-6-gpi／IL-21瘤苗抑制小鼠黑色素瘤肺转移的效应与机制初探被引量：2
- 2014年
- 目的探讨B16F10—ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗抑制小鼠黑色素瘤肺转移的效应和机制。方法将12只C57BL／6小鼠，分为瘤苗免疫组（给予B16F10-ESAT-6-gpi／IL-21瘤苗免疫）和对照组（未给予瘤苗免疫）。B16F10—ESAT-6-gpi／IL-21瘤苗免疫小鼠后，经尾静脉注射B16F10细胞，观察肺转移情况；采用细胞毒实验分析瘤苗免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性；酶联免疫吸附试验检测免疫小鼠的血清γ-干扰素（IFN-γ）水平；逆转录聚合酶链反应方法检测瘤组织中转化生长因子β2（TGF-β2）、锌指增强子结合蛋白1（ZEB1）、丝裂原活化蛋白激酶4和β-肌动蛋白的表达；免疫荧光检测瘤组织中E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白的表达。结果瘤苗免疫鼠肺部肿瘤的结节数明显少于对照组。对照组和瘤苗免疫组小鼠肺脏重量分别为（406．3±27．12）mg和（285．8±19．01）mg，差异有统计学意义（P=0．0054）。瘤苗免疫组小鼠CD8^＋T细胞对靶细胞的杀伤率[（42．62±3．465）％]明显高于对照组[（22．29±1．804）％]，差异有统计学意义（P=0．0032）。瘤苗免疫组和对照组小鼠血清中IFN-γ水平分别为（55．200±7．173）pg／ml和（6．435±1．339）Pg／ml，差异有统计学竞义（P=0．0003）。免疫鼠瘤组织TGF-β2、ZEB1、N-钙黏蛋白表达水平下降，而E-钙黏蛋白表达水平上升。结论B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗免疫能抑制小鼠黑色素瘤肺转移，这与CD8^＋T细胞为主的细胞免疫应答有关，与瘤苗诱导高水平IFN-γ影响肿瘤组织上皮间质转换有关。
- 何向锋施文赵枫姝王建红徐小红谭清和孙永强陈登宇窦骏
- 关键词：黑色素瘤癌症疫苗小鼠
- B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗安全性及抗肿瘤效应研究被引量：4
- 2011年
- 目的:评估B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗用于C57BL/6小鼠的安全性及其诱导的抗肿瘤免疫效应。方法:应用免疫荧光、FCM检测瘤苗细胞ESAT-6-GPI的表达情况;以Western blot方法检测瘤苗细胞IL-21的表达情况;动物实验检测瘤苗体内应用的安全性;制备荷瘤鼠术后免疫模型,评价瘤苗免疫效果。结果:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞表面有靶抗原ESAT-6-GPI表达,并分泌IL-21。于C57BL/6小鼠皮下接种2×105个B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞,60天内未见致瘤,但能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。结论:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗致瘤性明显下降,低剂量应用具有安全性,能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。
- 何向锋王净余方流赵枫姝蔡凯张洪义陈峻崧陈登宇窦骏
- 关键词：IL-21ESAT-6GPI肿瘤疫苗
- 瞄准肿瘤干细胞多药耐药性基因的靶向治疗策略被引量：2
- 2011年
- 肿瘤干细胞(TSC)的学说得到了越来越多人的认可,而且多种TSC已被鉴定。当前TSC研究的重点之一是靶向治疗问题。有多项实验结果支持,TSC高表达ABC转运体是其多药耐药性的重要原因,因此,靶向TSC的ABC转运体在肿瘤化疗中起着关键作用。我们总结了靶向治疗TSC的ABC转运体的研究概况、存在问题及解决策略,以期在该领域研究能有更快进展。
- 张洪义窦骏
- 关键词：肿瘤干细胞ABC转运体多药耐药靶向治疗
- 表达ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗的构建及其活性鉴定被引量：4
- 2011年
- 为构建膜表达糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的结核杆菌早期分泌靶抗原6 kD(ESAT-6)和分泌IL-21的B16F10瘤苗并鉴定其活性,利用重叠PCR法构建pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21重组质粒,以脂质体转染重组质粒到B16F10细胞,G418筛选出阳性克隆,用RT-PCR、免疫荧光、FCM和Western blot检测瘤苗细胞靶抗原表达,用瘤苗细胞培养上清刺激小鼠CD8+T细胞,检测瘤苗所分泌IL-21的生物学活性。结果表明,pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21重组质粒DNA测序正确,B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗细胞目的基因ESAT-6表达于瘤苗细胞表面,增殖能力未受外源基因导入影响,分泌的IL-21具有生物学活性,为研究膜表达ESAT-6和分泌表达IL-21瘤苗的抗瘤效应奠定了基础。
- 何向锋王净余方流赵枫姝张洪义曹文虎窦骏
- 关键词：B16F10IL-21ESAT-6GPI
- 靶向上皮性卵巢癌SKOV3细胞ZEB1-shRNA重组体构建及功能研究被引量：3
- 2012年
- 目的:利用RNA干扰技术,降低人上皮性卵巢癌SKOV3细胞中锌指增强子结合蛋白1(ZEB1)基因的表达,观察ZEB1低表达对SKOV3细胞的生长影响。方法:用pSUPER-EGFP1载体构建针对人ZEB1基因的干扰质粒shZEB1,脂质体转染SKOV3细胞,G418筛选稳定转染细胞株,通过RT-PCR和Western blot检测ZEB1在SKOV3细胞中表达。用克隆形成、划痕试验、RT-PCR和致瘤试验分别检测转染细胞克隆能力、迁移力、miR-200c表达水平和在裸鼠的致瘤性。结果:成功构建shZEB1,稳定转染细胞株shZEB1-SKOV3内ZEB1表达下降,导致shZEB1-SKOV3细胞miR-200c表达增高,克隆能力、迁移力及致瘤性下降。结论:用RNA干扰技术可靶向降低卵巢癌细胞株SKOV3内ZEB1的表达,使其致瘤性降低,提示ZEB1可作为分子靶点用于上皮性卵巢癌靶向治疗。
- 陈登宇陈峻崧王净曹文虎张洪义杨翠萍张云霞窦骏
- 关键词：上皮性卵巢癌
- 利用巢式PCR扩增目的基因构建hsa-miR-200c真核表达载体及鉴定
- 2012年
- 目的用巢式PCR从人类基因组获取miR-200c及侧翼序列,构建hsa-miR-200c重组体,转染卵巢癌细胞系SKOV3,检测其对E-钙粘蛋白表达的影响,为miR-200c对肿瘤细胞基因表达调控奠定基础。方法据microRNA数据库设计人miR-200c及侧翼引物,提取人细胞基因组进行PCR和巢式PCR获得miR-200c及侧翼共307个碱基序列,连接到pIRES2-EGFP载体中,测序鉴定后再将的miR-200c基因经慢病毒载体系统转染SKOV3细胞,检测miR-200c过表达对卵巢癌细胞E-钙粘蛋白表达的影响。结果成功扩增出miR-200c及侧翼共307个碱基序列,构建的重组体pIRES2-EGFP-miR-200c测序正确,转染SKOV3细胞后miR-200c过表达引起E-钙粘蛋白表达增多。结论巢式PCR技术能有效地从基因组中扩取miR-200c及侧翼片段用以构建miR-200c表达载体,miR-200c过表达可引起卵巢癌SKOV3细胞E-钙粘蛋白表达增多,可能导致细胞间黏附性增高。
- 陈登宇陈峻崧王净曹文虎张洪义杨翠萍窦骏
- 关键词：巢式PCRMIR-200CSKOV3细胞
