吉林省自然科学基金(20130101139JC)
- 作品数：6 被引量：19H指数：4
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- 北京棒杆菌AS1.299高丝氨酸脱氢酶突变体L200F/D215K的异源表达及酶学性质被引量：2
- 2014年
- 【目的】对北京棒杆菌Corynebacterium pekinense高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)进行空间结构改造从而获得优良性能新酶。【方法】利用定点突变技术构建HSD双突变体L200F/D215A、L200F/D215E、L200F/D215G和L200F/D215K,并将其转入大肠杆菌E.coli BL21中进行高效表达,选取催化效率最高的双突变体L200F/D215K与双突变前的L200F进行动力学和酶学性质比较。【结果】HSD双突变体L200F/D215K的Vmax为36.92 U/mg,较L200F提高1.24倍;最适反应温度为37℃,较L200F提高2℃;最适反应pH为7.5,与L200F经验值相同;最适温度下的半衰期为4.16 h,较L200F提高1.12倍;L200F/D215K和L200F对有机溶剂和金属离子均表现出较好的抗性。【结论】HSD通过空间结构改造活力得到提高,并且其酶学性质得到优化。本研究有助于认识HSD突变体的酶学性质,为其新酶的研发利用提供有力依据。
- 申术霞朱运明闵伟红方丽许金坤
- 关键词：北京棒杆菌异源表达酶学性质
- 利用生物技术生产甲硫氨酸的研究进展被引量：4
- 2016年
- 甲硫氨酸广泛应用于饲料、食品、医药等诸多领域,其市场需求量逐年增长。现行的化学合成甲硫氨酸产物为外消旋混合物,且对环境污染严重,与生物技术生产甲硫氨酸相比,不具备可持续性。生物技术生产甲硫氨酸可分为微生物发酵法和酶法。科研人员一直尝试阐明甲硫氨酸生物合成途径并进行高产菌株的选育,但由于其合成途径复杂,尚未获得适用于工业生产的菌株。对于现有菌株,深入研究甲硫氨酸生物合成途径、扩大甲硫氨酸向胞外的输出量、对发酵培养基组分及工艺条件进行优化都是有效提高甲硫氨酸产量的途径。酶法生产甲硫氨酸可分为异构体拆分和化合物酶解,其中利用微生物酶实现D型向L型的转化更有助于增加L-甲硫氨酸得率;最新的化合物酶解法结合了基因工程及酶的固定化技术,在实际生产中也具有巨大潜力。本文总结了国内外甲硫氨酸生产近况,重点论述了微生物发酵法、酶法及二者相结合生产甲硫氨酸的最新研究进展,并针对甲硫氨酸的发酵生产特点,提出变构抑制的解除、复合硫源的应用及关键酶的稳定性三方面的问题及建议。鼓励将酶法与发酵法相结合,并提倡通过酶解植物蛋白获得甲硫氨酸的研究,以实现低成本、低污染、高产量、高纯度的甲硫氨酸生产。
- 王隆洋闵伟红
- 关键词：甲硫氨酸生物技术微生物发酵酶法生产
- 北京棒杆菌天冬氨酸激酶G377定点突变及酶学性质表征被引量：10
- 2014年
- 采用饱和定点突变和高通量筛选技术,对北京棒杆菌天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)AK Gly377位点进行突变,并筛选获得高活力突变体G377F,分离纯化后对G377F AK酶学性质进行表征。结果表明:突变体AK最适pH值为9.0,较突变前野生型(wide type,WT)最适pH值为8.5有所提高;最适反应温度与WT一致,均为25℃;半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h;pH耐受性在5 h内保持其活力50%以上,与WT 3 h内酶活力保持能力相同。G377F对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性。其中,Lys的抑制作用在一定程度上被解除,当Lys和Met同时存在时对AK具有明显的激活作用。动力学研究显示:G377F AK Vmax较WT提高9.3倍;n值为1.0明显低于WT的2.7,说明AK正协同性降低,趋向于米氏酶。
- 朱运明王晓飞闵伟红詹冬玲王隆洋
- 关键词：北京棒杆菌天冬氨酸激酶定点突变酶学性质
- 北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体R169H的构建及酶学性质表征被引量：6
- 2014年
- 【目的】提高北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)中天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)活力。【方法】利用定点突变技术对AK基因进行突变,并将突变体转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中异源表达。重组菌经超声破碎后、利用镍柱对AK进行纯化,并经SDS-PAGE和Western blot验证。通过检测酶活力比较突变体和野生型动力学变化并研究突变体和野生型的部分酶学性质。【结果】成功构建突变体R169H。经验证知,AK分子量为48kDa。突变体R169H的Vmax为226.3 U/mg·s-1,较野生型提高2.3倍。最适反应温度为26℃,与野生型经验值相同;最适反应pH为9.0,较野生型经验值8.0有所提高;在最适温度和pH值下的半衰期为5.5 h,比野生型的4h稳定性要好;代谢产物赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸在低浓度时对AK均具有激活作用。【结论】突变体中R169与E92间氢键消失,能够影响亚基间聚合度,降低酶对底物的亲和力,减弱代谢产物对AK的反馈抑制作用,从而使R169H中AK的Vmax提高2.3倍。
- 李慧颖朱运明闵伟红詹冬玲任军
- 关键词：北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变酶学性质
- 天冬氨酸激酶突变体G277K中AK基因的克隆表达及酶学性质表征被引量：3
- 2014年
- 通过序列比对和晶体结构分析发现,天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)的G277位点高度保守,并与抑制剂Thr通过氢键相连,对其进行定点突变和酶学性质表征。结果表明:突变体G277K的AK最适反应条件是30℃、pH 8.5;动力学实验结果显示突变体AK的正协同效应降低,趋向于米氏酶,参数S0.5、nH、酶比活力、Vmax分别是7.05 mmol/L,1.24、964.3 U/mg、32.143 U/(mg·min);热稳定性实验显示,其30℃半衰期为2.3 h,3 h后酶活力丧失80%左右;Ni2+在低浓度时表现出显著的激活效应;有机溶剂丙三醇、异丙醇和二甲基亚砜的体积分数为1%时,对AK的酶活力有很好的激活作用,表明突变体AK对一些有机溶剂有一定的抗性;低浓度的赖氨酸和蛋氨酸对AK有激活作用。
- 任军闵伟红詹冬玲方丽李慧颖朱运明
- 关键词：天冬氨酸激酶克隆表达定点突变酶学性质
- 天冬氨酸激酶代谢调控的研究进展被引量：4
- 2016年
- 在微生物发酵合成天冬氨酸族氨基酸的代谢途径中,天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)是限制碳源和氮源流速的限速酶,是决定能否获得高产天冬氨酸族氨基酸的关键之一。本文介绍了AK的重要性、不同来源AK的整体结构、效应结合位点的特点和调控机制研究进展,并对AK代谢调控的发展做出展望,为进一步明确AK代谢调控机制,促进天冬氨酸族氨基酸产业化发展提供参考和依据。
- 杨宇亭闵伟红
- 关键词：天冬氨酸激酶
