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生物素化ATP硫酸化酶的表达、固定化与应用被引量：9: 2009年; 现代大规模焦测序技术的产生是DNA测序技术的一次革命,其关键技术之一是得到高活性的、固定于磁性微球表面的ATP硫酸化酶.生物素化的ATP硫酸化酶可以通过生物素与亲和素之间的特异结合特性固定在包被亲和素的磁性微球表面,但是利用化学修饰法将ATP硫酸化酶进行生物素化修饰很可能会影响酶的活性.利用融合表达策略,将大肠杆菌生物素酰基载体蛋白C端87个氨基酸肽段(BCCP87)与ATP硫酸化酶在大肠杆菌内融合表达,经SDS-PAGE和Westernblot分析,表达的融合蛋白分子质量约为64ku,并且能够在大肠杆菌内被生物素化.生物素化的ATP硫酸化酶能够与亲和素包被的磁珠结合,固定后的ATP硫酸化酶具有活性,并且能够用于定量检测焦磷酸盐(PPi)和焦测序,为今后建立高通量大规模焦测序系统提供了一个有效的工具酶.; 邹秉杰罗娟武海萍周国华; 关键词：ATP硫酸化酶生物素化固定化

大肠杆菌表达系统的研究进展被引量：60: 2005年; 近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽。文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述。; 戎晶晶刁振宇周国华; 关键词：大肠杆菌表达系统宿主细胞重组蛋白

重组丙酮酸磷酸双激酶与荧光素酶偶联催化ATP-AMP循环反应被引量：1: 2008年; 丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate phosphate dikinase,PPDK;EC 2.7.9.1)能够可逆催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)、单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)和焦磷酸盐(pyrophosphate,PPi)生成三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)、无机磷酸盐(orthophosphate,Pi)和丙酮酸(pyruvate).以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到了编码PPDK的基因,将此基因片段插入表达载体pET24a(+),在大肠杆菌中表达C端融合His-Tag的重组PPDK.与我们先前表达的N端融合His-Tag的PPDK相比,酶的活性提高了20倍,提示该酶的N端对活性十分重要.重组PPDK单体分子量为98 kD.经过镍亲和层析和超滤后,重组PPDK基本达到电泳纯.重组PPDK与荧光素酶偶联能够形成1个ATP-AMP循环反应,在该循环反应中,荧光素酶催化ATP生成的AMP和PPi能够被PPDK重新转化成ATP,产生一个持续稳定的信号.; 邹秉杰陈颖马寅姣周国华; 关键词：丙酮酸磷酸双激酶

ALM-ASA法鉴别人参和西洋参ITS及5．8s基因上单核苷酸多态性位点被引量：6: 2008年; 目的:查找并发现参类药材的单核苷酸多态性(SNP)位点,利用SNP的准确测定来鉴别人参和西洋参。方法:根据ITS及5.8s基因上人参和西洋参的SNP位点设计特异性引物,利用适配器连接介导的等位基因特异性扩增法(ALM-ASA)进行检测。结果:PCR反应体系优化后,能在同一反应中同时鉴别人参、西洋参。根据凝胶电泳中扩增片段的大小判断SNP的类型,出现294bp条带的为人参,111bp条带的为西洋参。结论:ALM-ASA法极大提高了PCR反应的特异性,结果准确,可同时测定多个SNP位点。采用该方法测定ITS及5.8s基因上的SNP位点能有效地对参类品种进行鉴别和质量控制。; 宋沁馨张心悦卜莹周国华冯芳; 关键词：人参西洋参

酿酒酵母ATP-硫酸化酶在大肠杆菌中的表达纯化及其在焦测序中的应用被引量：9: 2007年; ATP-硫酸化酶(ATPS,EC2.7.7.4)是一种可逆催化ATP和SO42-反应生成腺嘌呤-5′-磷酸硫酸(APS)和焦磷酸盐(PPi)的酶,已经用于焦测序反应。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisias,CICC1202)基因组DNA为模板,用PCR扩增得到ATPS基因,并克隆到原核表达质粒pET28a(+),得到重组表达质粒pET28a(+)-ATPS,在IPTG诱导下,携带pET28a(+)-ATPS的大肠杆菌BL21(DE3)表达分子量约为60kD的带有His标签的ATPS酶,经镍亲和层析和超滤两步纯化后,可得到电泳纯级ATPS,比活达5.1×104u/mg,并成功应用于焦测序反应中。; 罗娟吴文娟邹秉杰周国华; 关键词：酿酒酵母纯化

碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量被引量：10: 2009年; 建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称"SRPP")。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签,PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码,使得测序结果中的序列代表基因的来源,峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证,结果表明,SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量,并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。; 张晓丹武海萍陈之遥周国华; 关键词：焦磷酸测序基因表达

利用孕妇血浆中胎儿DNA进行无创性产前诊断的研究进展被引量：4: 2007年; 产前诊断对于预防及控制新生儿发病率具有十分重要的意义。目前,大多数的产前诊断方法对孕妇和胎儿具有潜在的损伤,所以临床医生一直在寻找新的无创性产前诊断技术。研究表明胎儿细胞存在于孕妇外周血中,但由于其数量较少,而且存在个体差异,因此很难应用于临床。最近的研究发现母体血浆或血清中存在高浓度的游离胎儿DNA。近年来,随着分子生物学技术的发展,从孕妇血浆或血清中检测胎儿DNA并应用于临床成为可能,为无创性产前诊断开辟了一种新途径。本文着重介绍游离胎儿DNA的来源、特点及在无创性产前诊断中的应用。; 罗娟周国华; 关键词：无创性产前诊断胎儿DNA 孕妇血浆

指数线性聚合酶链式反应法制备焦磷酸测序反应的单链模板被引量：9: 2009年; 建立了一种简单的焦磷酸测序用单链模板制备方法,以包含SNP6位点一段78bp序列为对象,采用非热启动Taq酶进行指数线性PCR扩增,通过加入甘油、BSA等PCR增强剂增加反应的效率和特异性,设计反应液A和B处理PCR产物中干扰焦测序的限制性引物、未完全反应的产物、焦磷酸和dNTPs等杂质,处理后1～2μLPCR产物就可直接用于焦测序检测。测定了BRCA1基因中5个乳腺癌相关的SNP位点,获得的图谱无非特异性信号,测得序列与参考序列一致,能够进行SNP分析,表明本方法可以制备高质量焦测序单链模板,且使焦测序的成本显著降低,操作更为简便,减少了操作过程中样本间的交叉污染,有利于焦测序样品预处理的自动化。; 杨会勇奚涛梁超陈之遥徐定邦周国华; 关键词：单核苷酸多态性

用于毛细管电泳和芯片电泳DNA分离的筛分介质: 2006年; 毛细管电泳和微芯片电泳是用于核酸分子分离的强有力工具,其筛分介质的选择尤为重要,是目前研究的热点之一。本文是按照均聚物和共聚物的分类,综述了线性聚丙烯酰胺、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烷、聚 N,N-二甲基聚丙烯酰胺、丙烯酰胺与聚 N,N-二甲基聚丙烯酰胺的共聚物等各种筛分体系的性质,包括其优点以及缺点,并对各自在 DNA 等生物大分子分离方面的应用进展进行了评述。简要介绍了筛分机理以及添加剂的加入对提高聚合物的分离能力和稳定性的影响。; 黄欢周国华; 关键词：毛细管电泳 DNA分离

粪便DNA突变检测在快速筛选大肠癌中的应用被引量：6: 2006年; 大肠癌是发病率和死亡率都很高的常见疾病,对高危人群进行大规模的普查筛选,可以降低大肠癌的发生率和死亡率。粪便DNA突变检测是新近发展的可用作大肠癌普查的技术,与常规结肠镜检测和大便隐血实验相比,具有特异性高、灵敏度高和易于被患者接受等优点。文章阐述了粪便DNA突变检测的相关基因、肿瘤特异性DNA提取方法和检测方法等,并对其在快速筛选大肠癌中的应用进行了展望。; 吴文娟周国华; 关键词：大肠癌

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