国家自然科学基金(31160506)
- 作品数：8 被引量：14H指数：3
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- 单核细胞增多症李斯特菌InlC基因缺失株的构建与鉴定
- 2015年
- 为探讨单核细胞增生性李斯特菌(Lm)InlC基因在Lm致病性中的作用,本研究对其进行缺失。以单核细胞增多症李斯特菌4b血清型临床分离株LM-90SB2DNA为模板,扩增出用于缺失InlC基因的上、下游同源臂。运用SOE-PCR技术,将上、下游同源臂融合扩增得到△InlC基因缺失片段。将△InlC基因缺失片段与自杀性质粒p KSV-7连接,构建p KSV7-△InlC质粒。电转p KSV7-△InlC于LM-90SB2感受态细胞中,经过10μg/m L氯霉素和41℃下连续传代15代,获得单交换重组株,然后在41℃氯霉素中传至第108代,获得双交换重组株,菌液用旁侧引物进行PCR鉴定,然后30℃无氯霉素条件下连续传代培养30代丢失自杀性质粒并检测其遗传稳定性。结果显示:获得LM90SB2-△InlC缺失突变株,旁侧引物扩增只有1条1480 bp大小的片段,同时,对缺失片段进行测序验证,结果表明成功对InlC基因进行了缺失,并且缺失株遗传稳定。LM90SB2-△InlC的构建为进一步研究InlC基因在LM毒力中的作用奠定了基础。
- 袁兆尤马勋
- 关键词：基因缺失电转化
- 变溶菌素(Mutanolysin)酶解单核细胞增多性李斯特菌细胞壁条件的优化被引量：1
- 2016年
- 为了最大效率提取单核细胞增多性李斯特菌LB90SB2细胞壁表面蛋白,本研究对变溶菌素浓度和酶解时间进行了优化。选择20、60μg/m L的变溶菌素浓度进行30 min-4 h,37℃酶解以及37和4℃低温联合酶解,通过测定酶解前后OD600和CFU,判断细胞膜完整性和计算原生质体形成率,筛选最佳酶解浓度和酶解时间。在最佳酶浓度的条件下,测定不同酶解时间细胞壁蛋白提取物浓度。结果表明:在酶解30 min-4 h,原生质体形成率从0提高至91.00%,细胞壁蛋白浓度从0.272增加至1.735 mg/m L。△OD600在1.86%-14.50%变动,但△OD600的统计学处理差异不显著。60μg/m L变溶菌素作用4 h的原生质体形成率达到91.00%,远高于20μg/m L变溶菌素作用4 h的78%。最终确定变溶菌素浓度为60μg/m L,酶解时间4 h为酶解LM90SB2细胞壁的最佳条件。本研究为下一步研究细胞壁表面蛋白奠定基础。
- 丁剑曹树珠陈朔马勋
- 关键词：原生质体
- 食源性单增李斯特菌LPXTG蛋白基因的检测
- 单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)作为四大重要食源性病原菌之一,对人类及多种畜禽健康威胁极大。LM细胞胞壁表面分布多种毒力蛋白,在感染机体过程中发挥重要作用,其中有一类至关重要的...
- 丁剑马勋陈朔曹树珠王贝贝
- 关键词：PCR
- 单核细胞增多性李斯特菌对小鼠血脑屏障通透性的影响被引量：1
- 2012年
- 为研究小鼠感染单核细胞增多性李斯特菌(LM)90SB2株后血脑屏障通透性的变化,本实验采用ELISA方法检测小鼠血清中髓鞘碱性蛋白(MBP)的水平和甲酰胺-紫外分光光度法检测脑组织中伊文思蓝(EB)的含量。结果显示:MBP于感染后4 h开始升高,10 h后维持较高水平,10 h、24 h、48 h、120 h和144 h各时间点与对照组比较均有显著性差异(p<0.05);EB在感染后24 h之内无明显增加,24 h后有较大幅度升高,并且与对照组比较存在显著性差异(p<0.05);但72 h后开始缓慢下降。表明小鼠感染LM后会导致血脑屏障通透性一定程度的升高。
- 郑德良马勋
- 关键词：血脑屏障髓鞘碱性蛋白伊文思蓝
- 食源性单增李斯特菌LPXTG蛋白基因的检测
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- 丁剑马勋陈朔曹树珠王贝贝
- 关键词：PCR
- 文献传递
- 单核细胞增多性李斯特菌对人、鼠脑微血管内皮细胞黏附、侵袭、增殖差异性分析被引量：4
- 2014年
- 为探究单核细胞增多性李斯特菌（LM）不同菌株对脑微血管内皮细胞黏附,侵袭以及在细胞内增殖的差异,本实验利用LM90SB2、LM3、LM4,塞氏李斯特菌（L.seeligeri）,无害李斯特菌（L.innocua）感染脑微血管内皮细胞,采用BHI平板计数,测定细菌黏附率、侵袭率及不同时间细胞内增殖情况。结果表明：LM90SB2、LM3、LM4对脑微血管内皮细胞黏附率为3.14%～7.83%,统计学分析其差异不显著;LM90SB2、LM3、LM4对人/鼠脑微血管内皮细胞侵袭率（0.036%～0.128%）均大于L.seeligeri（0.0315%、0.00148%）,L.innocua不侵袭脑微血管内皮细胞。LM90SB2、LM3、LM4对人/鼠2种细胞的侵袭率存在显著差异（P〈0.05）,临床分离株LM90SB2增殖速度、菌量及持续时间明显高于其它菌株。以上结果提示LM不同菌株的毒力不同。
- 邓兴梅魏丽马勋蒋建军于佳佳吴学林
- 关键词：LM脑微血管内皮细胞增殖
- 单增李斯特菌新疆临床分离株毒力基因的克隆和序列分析被引量：5
- 2014年
- 为了研究单增李斯特菌新疆羊源临床分离的4b血清型菌株(简称LM90)毒力基因的变异情况,参考Genbank上收录的单增李斯特菌4b血清型菌株F2365(GeneBank登陆号AE017262)的Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因序列,分别设计引物,对LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的最大开放阅读框进行PCR扩增,回收基因序列,连接到PMD19-T载体上进行克隆,筛选阳性菌进行序列的测定,将序列提交到NCBI上(登录号分别为KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612),测序后用DNAMAN软件对序列进行分析。结果显示:LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ与F2365毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的同源性分别为98.04%、96.53%、98.20%、96.41%、98.23%,氨基酸的同源性分别为99.73%、99.83%、98.67%、99.66%、99.76%,可见单增李斯特菌新疆临床分离株LM90毒力基因Ami、Auto、InlB,InlC、InlJ序列相对稳定。
- 于佳佳邓兴梅蒋建军朱江虹马勋
- 关键词：单增李斯特菌毒力基因克隆
- 单核细胞增多性李斯特菌对小鼠血脑屏障超微结构的影响被引量：2
- 2013年
- 为了探讨单核细胞增多性李斯特菌(LM)90SB2株感染小鼠后,其血脑屏障超微结构的变化,本试验通过制作超薄切片,在透射电镜下观察血脑屏障超微结构的变化。结果显示:血管内皮细胞吞噬小泡明显增加,部分紧密连接明显松散,星形胶质细胞足突出现明显异常,主要表现为胞质局部有肿胀、增厚(数倍于正常),呈空泡状附着在毛细血管基板外,其内见肿胀的线粒体,内质网、微丝和其他细胞器减少,大量的神经细胞和胶质细胞坏死、崩解,并且脑组织中有大量的小胶质细胞出现。结果提示,LM90SB2感染后,血脑屏障严重破坏,血管通透性增加,导致大量炎性细胞出现在脑组织。
- 郑德良马勋
- 关键词：李斯特菌血脑屏障超微结构小鼠
- 人脑微血管内皮细胞ACTG1基因真核表达载体的构建及表达被引量：3
- 2016年
- 为了构建人脑微血管内皮细胞ACTG1基因的真核表达载体及在HEK293细胞中的表达,本研究采用RT-PCR方法,以单增李斯特菌侵染的人脑微血管内皮细胞提取的总RNA为模板,扩增ACTG1基因片段,TA克隆后经Sal I和Eco R I双酶切、测序等鉴定重组质粒,重组质粒再经双酶切,与真核表达载体p ACGFP连接,酶切鉴定后,Lipofactamine 2000转染HEK293细胞,荧光显微镜检测绿色荧光;同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:PCR扩增得到1128 bp的ACTG1基因片段,ACTG1-p ACGFP真核表达载体构建成功,转染24 h后,在荧光显微镜下可见绿色荧光,Western-blotting检测分析,其分子量约为68 k Da的融合蛋白,与预期的大小相符合,表明重组蛋白表达成功,本研究为单增李斯特菌与脑微血管内皮细胞c DNA文库中相互作用蛋白的筛选和鉴定奠定了基础。
- 曹树珠马勋陈朔丁剑
- 关键词：人脑微血管内皮细胞HEK293细胞单增李斯特菌
- 单核细胞增多性李斯特菌人工感染小鼠致其脑炎模型的建立及优化被引量：1
- 2013年
- 采用不同剂量单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)LM90SB2腹腔注射感染小鼠219只,观察小鼠临床症状,纪录死亡情况,在感染后不同时间采集小鼠脑组织,进行脑组织中细菌回收、鉴定及病理组织学观察。结果显示,不同感染剂量感染小鼠,其临床症状和脑组织病理变化基本一致。但是随着感染剂量的增加,其临床症状出现时间逐渐缩短,死亡率和脑组织中细菌分离的时间明显不同。1/2LD50剂量组小鼠未出现死亡,2/3LD50组和LD50组死亡率分别为12.5%和63.3%;另外1/2LD50组感染后24h开始从脑组织中离到LM,96h所有感染小鼠脑组织均能分离到LM,2/3LD50组感染后12h开始能分离到LM,72h所有脑组织均能分离到LM。从小鼠临床症状及死亡率、脑组织细菌的回收情况和脑组织病理组织学变化综合考虑,以2/3LD50LM LM90SB2腹腔感染小鼠为动物感染模型。
- 郑德良马勋
- 关键词：LM半数致死量小鼠模型病理学
