浙江省自然科学基金(Y2090337)
- 作品数：7 被引量：10H指数：2
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- 小鼠BrglshRNA慢病毒载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的沉默效应被引量：2
- 2013年
- 本研究拟构建慢病毒干扰载体高效下调BM—MSCs中Brgl蛋白水平，为进一步研究其在肝细胞分化中的功能奠定基础。
- 董学君孙荷张帆吕娟钱颖吴云路
- 关键词：骨髓间充质干细胞慢病毒小鼠肝细胞分化MSCS
- Brg1在肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用
- 2013年
- 小鼠胎肝细胞持续表达Brg1蛋白，且干扰Brg1可引起白蛋白（ALB）表达下降，提示其可能是调节肝细胞分化的重要因子。我们通过慢病毒载体干扰小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）中Brg1表达，探讨其在肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子4（FGF4）启动BM-SCs定向分化肝细胞中的作用及其机制。
- 董学君孙荷张帆吕娟卢韬钱颖吴云路
- 关键词：成纤维细胞生长因子肝细胞生长因子骨髓间充质干细胞肝细胞分化胎肝细胞定向分化
- 改良人骨髓间充质干细胞分离方法提高细胞定向分化能力被引量：6
- 2010年
- 目的改良人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)分离方法,提高细胞定向分化能力。方法用密度梯度离心法从少量人骨髓中分离得到单个核细胞,贴壁培养3天后换液,实验组换液后72h内每隔12h更换新鲜培养液,传代时胰蛋白酶37℃作用2min后终止消化;对照组未经频繁换液,胰蛋白酶消化3min。镜下观察分离细胞的形态变化。用成骨、脂肪和软骨细胞诱导液诱导两组第3代(P3)细胞分化,碱性磷酸酶钙钴染色法、茜素红染色法和VonKossa银染色法检测成骨细胞分化;油红O染色法检测脂肪细胞分化;阿尔新蓝染色法检测软骨细胞分化。结果首次换液72h后,实验组与对照组相比,贴壁细胞数量较少但形态均一性高。不同染色结果显示:诱导分化成骨细胞14天时,实验组95%以上细胞分化,对照组为60%～70%;诱导分化脂肪细胞21天时,实验组50%～60%细胞分化,对照组为40%;诱导分化软骨细胞21天时,实验组90%以上细胞分化,对照组为60%～70%。结论首次换液72h内频繁更换新鲜培养液和传代时缩短胰蛋白酶消化时间的方法能够提高hBM-MSCs的定向分化能力。
- 张卉董学君邵健忠项黎新
- 关键词：人骨髓间充质干细胞成骨细胞脂肪细胞软骨细胞
- 小鼠甲基转移酶EZH2基因慢病毒表达载体的构建及验证
- 2013年
- 目的构建小鼠组蛋白H3K27三甲基转移酶EZH2基因慢病毒载体及鉴定。方法以携带EZH2 cDNA的PCMV-SPORT6载体为模板,自行设计携带有Kpnl和Xmal酶切位点的引物PCR扩增出目的基因编码序列,扩增产物用内切酶酶切后定向克隆到慢病毒载体PLenti-eGFP-NEO中,通过PCR、酶切及测序验证载体;将重组慢病毒载体和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE及pMD2G组成的四质粒系统,共转染293T细胞包装成慢病毒,收集含病毒颗粒的细胞上清液,浓缩和纯化后得到高效价的病毒液,转染293T细胞进行效价测定。结果 PCR扩增出约2241bp的序列,构建的慢病毒载体测序结果与Gene-bank报道的目的基因序列一致;四质粒系统成功共转染入293T细胞中,在细胞中能够稳定表达,包装出了2.1×108TU/ml的病毒液。结论成功构建了小鼠EZH2基因慢病毒载体,并得到2.1×108TU/ml高效价的病毒液。
- 卢韬张帆孙荷吕娟杨明峰董学君
- 关键词：组蛋白甲基转移酶慢病毒载体293T细胞
- 甲基化转移酶Suv39h1基因慢病毒表达载体构建及鉴定
- 2012年
- 目的构建小鼠H3K9甲基转移酶Suv39h1基因慢病表达毒载体。方法设计并合成带有Kpnl和Xmal酶切位点的引物,以携带Suv39h1 cDNA的PCMV-SPORT6载体为模板扩增目的基因,将其与Lenti-eGFP-Neo载体双酶切,T4连接酶连接,构建成PLenti-eGFP-Suv39h1重组载体,转化感受态细胞DH5α,PCR筛选阳性克隆质粒,酶切与测序鉴定正确后,将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞,包装及效价测定。以感染复数(MOI值)为10和30的慢病毒颗粒感染293T细胞,RT-PCR检测Suv39h1 mRNA表达。结果 PCR、酶切及测序结果均显示目的片段插入正确,四质粒共转染293T细胞后,镜下可见95%的细胞表达绿色荧光;效价测定为2.11×108TU/ml;RT-PCR检测显示,MOI值为30的Suv39h1表达量是MOI值为10的3倍,两者均可在293T细胞中均匀稳定表达。结论成功构建Suv39h1基因慢病毒表达载体,为后续Suv39h1基因功能研究奠定了基础。
- 张帆卢韬孙荷吕娟杨明峰董学君
- 关键词：组蛋白甲基转移酶慢病毒载体
- p38信号通路在小鼠骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞中的作用被引量：2
- 2011年
- 目的探索p38信号转导通路在损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)向肝细胞分化中的作用。方法将四氯化碳(CC l4)注射的小鼠肝脏进行培养,收集到的上清液即为损伤肝脏条件培养液;密度梯度离心法分离获得小鼠骨髓来源的骨髓间充质干细胞,采用反复贴壁筛选法纯化,培养并传代;将培养至第3～7代骨髓间充质干细胞分为3组:对照组、正常诱导组和抑制剂组,对照组用10%FBS的IMDM培养液培养,其余两组均加入损伤肝脏条件培养液,此外抑制剂组再加入p38信号转导通路抑制剂SB203580至终浓度10.5μmol/L。结果①正常组在诱导处理21天后,相差显微镜下观察,细胞形态由梭形、纤维样分化为多边形或上皮样,胞核清晰,并出现双核或多核;而抑制剂组在诱导处理21天后,细胞形态改变的比例明显减少;②p38信号通路抑制剂SB203580作用于抑制剂组中骨髓间充质干细胞7天后,肝细胞分化特异性指标AFP在诱导第7天时、ALB以及分泌尿素量在诱导第14天和第21天时,与正常诱导组相比,明显减少(P<0.05,n=5)。结论丝裂原激活蛋白酶p38的活化可能在损伤肝脏条件培养液诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞过程中起重要作用。
- 杨超董学君
- 关键词：P38骨髓间充质干细胞肝细胞细胞分化
- Jmjd3基因慢病毒干扰载体的构建及其去H3K27三甲基化作用研究
- 2013年
- 目的构建针对小鼠Jmjd3基因的RNAi慢病毒载体,感染小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,mBM-MSCs)后观察其对Jmjd3基因表达的影响及对组蛋白H3K27me3的去甲基化作用。方法根据Jmjd3mRNA序列设计并合成3对shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入PLL3.7慢病毒干扰载体,双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,重组质粒与其他3种辅助包装质粒(pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G)共转染293T细胞生产病毒液,病毒液感染mBM-MSCs,荧光定量PCR和Western blot检测目的基因Jmjd3的表达,筛选出最有效的干扰序列。Western blot检测组蛋白H3K27me3的表达量,分析Jmjd3的生物学功能。结果双酶切和测序结果证实Jmjd3基因shRNA序列正确插入慢病毒载体。荧光定量PCR和Western blot结果显示,感染后Jmjd3表达显著下调,与空载体对照组相比,Jmjd3-shRNA1组、Jmjd3-shRNA2组和Jmjd3-shRNA3组分别下调88.9%(P<0.001)、67.9%(P<0.001)和72.4%(P<0.001),Jmjd3-shRNA1组为最佳干扰组。Western blot结果显示干扰Jmjd3之后,H3K27me3的表达较空载体对照组升高。结论成功构建了针对小鼠Jmjd3基因的慢病毒干扰载体,并能有效抑制mBM-MSCs中Jmjd3基因的表达,Jmjd3具有组蛋白H3K27me3的去甲基化作用。
- 吕娟孙荷张帆董学君
- 关键词：慢病毒载体组蛋白去甲基化酶间充质干细胞
