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串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达被引量：2: 2005年; 利用D_泛解酸内酯水解酶N末端序列,并根据NCBI中公布的D_泛解酸内酯水解酶cDNA序列设计了一个特异引物,该引物结合Oligo(dT) 1 5,以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0 5 36mRNA反转录得到的总cDNA为模板进行扩增,获得约1 5kb左右的片段,将其克隆到T载体上进行测序,对测得的序列进行分析,重新设计了一对引物,并在引物两端分别加上限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别位点序列,利用热启动PCR成功地扩增出了D_泛解酸内酯水解酶基因,基因片段长度为114 6bp ,该序列同来源于尖镰孢霉菌(F .oxysporum)AKU 370 2菌株的编码D_泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的同源性为90 0 6 %。将所得片段定向克隆到pTrc99a载体中,转化至JM10 9感受态细胞,筛选出了阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,进行SDS_PAGE电泳,检测出在约4 0kD处有一蛋白表达带。对两株重组基因工程菌的比活力进行测定,结果分别为37U和4 1U。; 柳志强孙志浩

4-氯乙酰乙酸乙酯羰基还原酶产生菌的筛选及产酶条件研究被引量：6: 2005年; 从实验室保藏的菌株中,筛选到一株立体选择性较高的产4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)羰基还原酶的菌株———出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)SW0202,菌体产酶条件研究表明,最佳的发酵培养基配方为:麦芽糖30.0g/L,酵母膏20.0g/L,蛋白胨3.0g/L,(NH4)2SO45.0g/L,KH2PO42.0g/L,MgSO4.7H2O0.7g/L,最适发酵温度及初始pH分别为:28°C和pH6.0。该菌在此条件下发酵培养24h,产菌丝体生物量16.78g干菌体/L,COBE羰基还原酶酶活力达到1007U/L。在COBE的转化反应中,产物S-CHBE的浓度达到10.12g/L,光学纯度>97%e.e.。; 钟萍衡湘斐孙志浩; 关键词：产酶条件发酵手性醇出芽短梗霉

D-泛解酸内酯水解酶的定向进化被引量：10: 2005年; 易错PCR结合DNA改组方法向D泛解酸内酯水解酶基因中引入突变,并构建突变体库。利用酶的催化特点和产物特性建立了基于平板初筛和高效液相复筛的两步法D泛解酸内酯水解酶活性筛选系统。用该筛选系统以酶活力和pH稳定性为指标对突变体库进行筛选,最终获得一株酶活力高且在低pH条件下稳定性好的突变体MutE861。该突变体的酶活力是野生型酶的5.5倍。对突变体和野生型酶在pH6.0和pH5.0条件下的残余酶活进行对比,在这两种pH条件下,突变体酶的酶活残留分别为75%和50%,而野生型酶只能保持原来的40%和20%。通过软件对突变体MutE861酶基因和野生型酶基因进行分析对比,发现突变体MutE861酶基因发生了三处点突变,其中突变使两处氨基酸取代,另一处为沉默突变,未引起氨基酸的变化。; 柳志强孙志浩郑璞冷泳钱嘉南; 关键词：易错PCR DNA改组定向进化

4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯羰基还原酶产生菌的筛选及产酶条件研究被引量：2: 2007年; 对实验室保藏菌种进行筛选,得到一株葡萄汁酵母Saccharomyces uvarum SW-58,对其产酶条件进行优化,其发酵培养基组成:醋酸钠60 g/L,玉米浆30 g/L,KH2PO46 g/L,MgSO4.7H2O 1 g/L;培养条件为:发酵温度30℃,初始pH 6.0,发酵周期36 h。4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯羰基还原酶酶活最高可达388.1 U/L,产物的浓度由优化前的3.5 g/L提高到4.6 g/L,所得产物的光学纯度由优化前的60.8%e.e.提高到85.0%e.e。; 茆旭东何军邀孙志浩郑璞; 关键词：羰基还原酶

酶的定向进化及其应用被引量：14: 2005年; 综述了生物催化剂(酶)分子定向进化的产生、原理、方法及应用,深入阐述酶分子定向进化过程中的相关问题,重点介绍了易错PCR(Error-prone PCR)和DNA改组(DNA shuffling)等几种典型的酶定向进化方法与成功实例,展望了生物定向进化研究的发展前景。; 孙志浩柳志强; 关键词：生物催化剂蛋白质工程定向进化易错PCR DNA改组

葡萄汁酵母SW-58不对称还原4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯的研究被引量：1: 2008年; 对实验室保藏菌种进行筛选,得到一株葡萄汁酵母Saccharoinyces uvarum SW-58,能够催化还原4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯生成(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯。在优化条件下,摩尔转化率达到77.0%,产物的对映体纯度88.9%e.e.,产物浓度达到15.7 g/L,产物浓度得到了显著的提高,达到优化前的3.3倍。; 茆旭东何军邀孙志浩郑璞; 关键词：羰基还原酶

手性技术与生物催化被引量：31: 2004年; 简要介绍了手性 ,手性技术与生物催化的基本概念。手性 ,是指一个有机分子具有不对称性 ,形成两种空间排布方式不同的对映异构体。手性技术即生产手性化合物的技术 ,手性化合物的制备方法主要有手性源、外消旋体拆分、不对称合成等几种。生物催化 ,即利用酶或微生物等生物材料催化进行某种化学反应 ,被认为是手性化合物生产取得突破的关健技术。文章还介绍了生物催化外消旋体拆分。; 孙志浩; 关键词：手性手性技术生物催化

水/有机溶剂两相体系微生物催化不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯被引量：8: 2007年; 研究了水/有机溶剂两相体系中,出芽短梗霉SW0202细胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)的过程。有机溶剂的选择表明邻苯二甲酸二丁酯为该反应最适有机溶剂,与单一水相体系相比,水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系能明显改善反应效率。通过系统考察一些因素如相体积比、振摇速度、反应温度和pH等对反应速度、摩尔转化率和产物光学纯度的影响发现,这些因素对还原反应的初速度和摩尔转化率有较明显的影响,而对产物的光学纯度影响不明显。优化后的条件为:水与有机溶剂的相体积比1:1,振摇速度180r·min-1,温度30℃,pH7.0。在该优化反应条件下,水/有机溶剂两相体系中出芽短梗霉SW0202细胞催化COBE生成(S)-CHBE不对称还原反应的最大摩尔转化率和产物的光学纯度分别达到了94.8%和97.9%e.e.,在用Na2CO3溶液控制水相pH7.0条件下,有机相中的产物浓度积累达58.2g·L-1。; 何军邀孙志浩郑璞韩丽

生物催化不对称还原方法生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯被引量：10: 2005年; 通过筛选得到不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)对映选择性好的微生物菌株出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)SW0202.对其还原反应条件进行优化,得到最佳转化条件为:初始细胞浓度0.32g/mL(以湿菌体计),底物浓度20g/L,pH7.0,温度30℃.在此优化条件下,产物浓度达20.32g/L,摩尔转化率为79.6%,产物对映体过量值e.e.为97.8%.分批添加底物可显著减小底物的抑制作用.; 钟萍孙志浩; 关键词：生物催化不对称还原反应

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国家自然科学基金(20476039)