国家自然科学基金(30370072)
- 作品数：10 被引量：17H指数：2
- 相关作者：严杰罗冬娇胡野孙百莉廖苏梅更多>>
- 相关机构：浙江大学杭州师范大学金华职业技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省教育厅科研计划北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 利用SYBR Green检测衣原体Real-Time PCR方法的建立被引量：2
- 2006年
- 利用SYBR Green建立了检测种特异性衣原体的Real-Time PCR方法。本方法应用衣原体种特异性的高度保守特异引物，能够扩增627bp特异片段；使用定量标准基因组DNA，本方法能准确检测最少250fg衣原体DNA。Real-TimePCR方法与免疫荧光方法的检测结果表明：检测4种衣原体临床样本，Real-TimePCR敏感性均在96％～98%；特异性均为100％；这两种方法符合率达97％以上（n=60）；批内和批间重复性试验结果表明，本方法具有良好的准确性。本方法的建立对于快速、准确检测临床样本种特异性衣原体提供了一种切实有效的方法。
- 杨建民郝永新赵德明何诚
- 关键词：SYBR衣原体REAL-TIMEPCR
- 问号钩端螺旋体鞭毛蛋白相关蛋白FliH／I／Y／N基因原核表达和膜定位被引量：1
- 2008年
- 目的克隆问号钩端螺旋体（简称钩体）鞭毛相关蛋白编码基因fliH、fliI、fliY和fliN并构建其原核表达系统，制备表达产物抗血清并了解其蛋白的定位。方法以苯酚-氯仿法提取的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板，用PCR扩增全长fliH、fliI、fliY和fliN基因片段，T-A克隆后测序，继而构建上述目的基因克隆的原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图像分析系统检查重组蛋白rFliH、rFliI、rFliY和rFliN的表达情况，Ni-NTA亲和层析法提纯目的表达产物。皮下免疫家兔获得4种目的重组蛋白抗血清，用ELISA和Western blot分别检测抗血清效价并了解抗血清与相应抗原结合的能力。采用免疫电镜技术对fliH、fliI、fliY和fliN进行定位。结果PCR扩增获得大小分别为924、1365、1065和318 bp的全长fliH、fliI、fliY和fliN基因片段，与报道的序列比较，其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统均能有效地表达目的重组蛋白，其产量均约为20％。rFliH、rFliI、rFliY和rFliN蛋白免疫家兔后能产生抗体，其兔抗血清ELISA效价达到1：100000以上，并分别识别钩体相应重组蛋白和膜蛋白提取物而出现明显的Western杂交条带。fliH、fliI、fliY和fliN蛋白分布于问号钩体内膜、外膜或内外膜之间。结论本研究成功地构建了能高效表达问号钩体鞭毛相关蛋白fliH、fliI、fliY和fliN的原核表达系统，并获得了能有效识别上述蛋白抗原的高效价抗血清。鞭毛相关蛋白fliH、fliI、fliY和fliN是问号钩体内膜或外膜蛋白成分。
- 徐韩飞阮萍廖苏梅杨平毛亚飞李立伟严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体原核表达
- 我国主要问号钩端螺旋体血清群lipL21基因序列及其产物免疫反应性分析被引量：8
- 2006年
- 目的分析我国15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列,构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性,了解lipL21基因自然表达状况。方法高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Patoc型PatocⅠ株基因组DNA中全长lipL21基因片段,T-A克隆后测序并构建其原核表达系统。分别用钩体TR/PatocⅠ和rLipL21兔抗血清为一抗的Western blot鉴定目的重组蛋白rLipL21的免疫原性,显微镜凝集试验(MAT)检测rLipL21兔抗血清的交叉凝集效价。以盐变-去垢剂处理法提取钩体外膜蛋白,用SDS-PAGE和免疫印迹法检测上述钩体株lipL21基因自然表达情况。结果上述钩体株均存在序列高度保守的lipL21基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98．75％～99．82％和99．46％～100％。rLipL21能与TR/PatocⅠ及rLipl21兔抗血清发生结合反应。rLipL21免疫家兔能产生抗体,该抗体对上述15株问号钩体MAT效价为1：16～1：128。问号钩体外膜标本中均可检出LipL21,双曲钩体则否。结论我国钩体群参考标准株均含有序列保守的lipL21基因并自然表达于外膜,双曲钩体PatocⅠ株虽含有lipL21基因但未表达。rLipL21具有良好的抗原性和免疫反应性,有可能作为新型钩体疫苗或检测试剂盒的候选属特异性表面抗原之一。
- 罗冬娇胡野孙百莉田菊霞胡美多严杰
- 关键词：钩端螺旋体外膜蛋白
- 问号钩端螺旋体病人血清中LipL21抗体检测被引量：1
- 2007年
- 寻找钩体属特异性保护抗原，对于研制通用型钩体疫苗及实验室诊断试剂盒均有重要价值。Cullen等首先报告了致病性问号钩体均具有属特异性lipL21脂蛋白基因。我们也曾证实我国15群15型问号钩体参考标准株均含有序列保守的lipL21基因。已知钩体病免疫保护作用主要依赖血清抗体为主的体液免疫。我们采用显微镜凝集试验（MAT）检测了156份钩体病人血清的凝集效价，并建立rLipL21-IgM／IgG-ELISAs对血清标本中LipL21的IgG和IgM型抗体进行了检测。
- 罗冬娇郭宗琪孙百莉蒋晓崎周金成严杰
- 关键词：抗体检测病人血清问号钩端螺旋体免疫保护作用
- 靶向敲除问号钩端螺旋体鞭毛相关fliN基因及其突变株致病性变化被引量：2
- 2009年
- 目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体）鞭毛相关Ⅲ型分泌系统∥洲基因产物的致病性。方法构建基因打靶载体p2NIL fliN-amp，采用基于自杀质粒与染色体同源序列重组的靶基因敲除技术构建不表达FliN的问号钩体赖型56601株突变株，采用PCR、测序和Westernblot对FliN-突变株进行鉴定。采用动力试验、MTT、Fontana镀银染色法和流式细胞术，对FliN-突变株的迁移能力、培养物上清对小鼠单核-巨噬样细胞株J774A．1的细胞毒性、黏附及诱导J774A．1细胞凋亡能力的改变进行分析。结果PCR、测序和Westernblot结果均证实成功构建了FliN‘突变株，该突变株能在含100μg/ml氨苄青霉素的Korthof培养基中生长及繁殖。FliN。突变株在Korthof半固体培养基上菌落直径（2—3mm）明显小于野生株（6～8mm），表明该突变株动力消失。FliN一突变株培养物上清作用J774A．1细胞72h时虽显示有细胞毒性，但明显低于野生株（P〈0．05）。FliN。突变株作用J774A．1细胞60rain时的黏附率（25．5％）明显低于野生株（47．5％）（P〈0．05），其引起J774A．1细胞坏死和细胞凋亡率（30．6％和22．7％）也明显低于野生株（48．2％和35．2％）（P〈0．05）。结论．fliN基因产物与问号钩体黏附细胞、分泌毒力因子和诱导细胞凋亡密切相关。采用基于自杀质粒基因敲除技术可用于研究问号钩体靶基因产物的致病机制。
- 楼宏强廖苏梅胡野严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体基因敲除突变株
- 问号钩体lipL32/1-lipL41/2融合基因的构建及其表达产物免疫性的鉴定(英文)
- 2007年
- 目的构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL41/2融合基因及其原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性。方法采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL41/2融合基因,常规方法构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL41/2表达情况。采用Western blot鉴定rLipL32/1-LipL41/2的免疫反应性。采用ELISA检测228例钩体病人血清中lipL32/1、lipL41/2基因和lipL32/1-lipL41/2融合基因表达产物的抗体。结果 lipL32/1-lipL41/2融合基因核苷酸和氨基酸序列与报道的相关序列相似性分别为99 .9 %和99 .8 %。rLi-pL32/1-LipL41/2表达量约为细菌总蛋白的10 %。rLipL32/1和rLipL41/2兔抗血清均能识别并与rLipL32/1-LipL41/2结合。97 .4 %、78 .5 %和99 .1 %病人血清rLipL32/1、rLipL41/2和rLipL32/1-LipL41/2抗体阳性。结论本研究成功地构建了问号钩体lipL32/1-lipL41/2融合基因及其原核表达系统,rLipL32/1-LipL41/2不仅同时具有两个单一重组抗原的免疫反应性,且能提高钩体病人血清中抗体检测阳性率,可作为研制钩体属特异性基因工程疫苗或检测试剂盒的候选抗原。
- 周金成罗冬娇严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体融合基因免疫性
- 问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB_2和fliR的克隆及原核表达系统的构建被引量：1
- 2006年
- 目的克隆问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR,并构建其原核表达载体。方法按常规苯酚-氯仿法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组DNA,高保真PCR扩增flhA、flhB2和fliR基因片段,T-A克隆后测序,构建原核表达载体,采用SDS-PAGE和免疫印迹法检测目的融合蛋白的表达。结果问号钩体56601株flhA、flhB2和fliR基因扩增片段的核苷酸序列与报道的相应序列同源性分别为100%、99·9%和99·9%,氨基酸序列同源性分别为100%、99·8%和100%。所构建的重组原核表达系统在IPTG的诱导下,能有效地表达目的融合蛋白Trx-FlhA、Trx-FlhB2和Trx-FliR,产量约为细菌总蛋白的10%。结论已成功构建了问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR原核表达系统。
- 王欣莹范洪学严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体克隆
- 问号钩端螺旋体fliN基因原核表达及其产物的鉴定被引量：1
- 2008年
- 目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用IPTG诱导目的重组蛋白rFliN表达。采用SDS-PAGE结合Bio-Rad凝胶图象分析系统检测rFliN表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rFliN。采用兔抗问号钩体黄疸出血群赖株全菌抗血清的Western blot鉴定rFliN及其免疫反应性。结果与报道的相应序列比较,所克隆的fliN基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。IPTG诱导原核表达系统pET32a-fliN-E.coliBL21DE3的rFliN表达量约占细菌总蛋白的30%,rFliN提纯后仅见单一的蛋白条带。rF-liN能与抗血清发生免疫结合反应。结论本研究成功地构建了高效表达目的重组蛋白的问号钩体fliN基因原核表达系统,RFliN有良好的免疫反应性,为深入研究FliN致病及免疫保护作用奠定了基础。
- 孙琦陈蔚青孙爱华严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体克隆原核表达
- fliR基因与问号钩端螺旋体黏附及损伤细胞功能相关性的研究被引量：1
- 2008年
- 目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)fliR基因的致病性。方法:分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因。构建fliR基因自杀质粒,并设计和合成特异性siRNA。采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA的基因沉默技术构建问号钩体fliR基因突变株,并用PCR、测序、半定量RT-PCR进行鉴定。采用小鼠单核-巨噬细胞J774A.1黏附试验和流式细胞术,检测敲除fliR基因的问号钩体突变株56601fliR-Kana、siRNA阻断fliR基因的问号钩体突变株56601siRNA-R2株黏附细胞,及诱导细胞坏死或凋亡能力的变化。结果:所克隆的fliR基因与GenBank中相应基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%和100%,所克隆的kana基因核苷酸序列与pET42a图谱完全相同。56601fliR-Kana可在含氨苄青霉素和卡那霉素的EMJH培养基中生长,PCR和测序结果证实56601fliR-Kana株fliR基因中插入了kana基因。56601fliR-Kana株fliR基因mRNA水平明显下降(P<0.01),56601siRNA-R2株fliR基因mRNA水平也低于野生株(P<0.05)。56601fliR-Kana和56601siRNA-R2黏附J774A.1细胞的能力基本消失,诱导J774A.1细胞坏死或凋亡的能力也明显减弱(P<0.01)。结论:fliR基因是问号钩体毒力相关基因,其功能与问号钩体黏附细胞、诱导细胞凋亡或坏死密切相关。
- 阮萍王欣莹孙爱华李世军严杰
- 感染细胞内问号钩端螺旋体吞噬泡形成及其与溶酶体的融合被引量：1
- 2007年
- 目的了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染宿主细胞后吞噬泡形成、吞噬泡与溶酶体融合及感染细胞超微结构改变。方法用问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核巨噬样细胞J774A.1和猴肾成纤维细胞Cos-7。采用透射电镜观察J774A.1细胞和Cos-7细胞胞内钩体吞噬泡的形成及感染细胞超微结构的改变。采用免疫双荧光染色法和激光共聚焦显微镜,观察含钩体吞噬泡与溶酶体融合情况。结果问号钩体56601株感染J774A.1细胞30 min、感染Cos-7细胞15 min即可在胞浆中发现膜包绕的含钩体吞噬泡,吞噬泡内钩体均保持原有生理弯曲。56601株问号钩体感染Cos-7细胞2h后,钩体吞噬泡膜开始消失,但未发现J774A.1细胞内钩体吞噬泡膜消失的现象。J774A.1细胞内钩体吞噬泡与溶酶体发生共区域化,表明吞噬泡与溶酶体发生融合。J774A.1细胞感染钩体后出现染色质浓缩形成的凋亡小体样结构、细胞空泡变性、线粒体肿胀等超微结构病变,但Cos-7细胞感染钩体后其超微结构基本正常。结论问号钩体感染J774A.1细胞和Cos-7细胞后可迅速形成吞噬泡并可能与钩体Ⅲ型分泌系统产物有关。J774A.1细胞内钩体吞噬泡可与溶酶体发生融合。不同细胞的钩体吞噬泡膜消失及超微结构改变有明显差异。
- 刘云英罗冬娇郑伟李立伟严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体超微结构改变
