国家科技支撑计划(2006BAI23B02)
- 作品数：13 被引量：16H指数：3
- 相关作者：胡宝成于芳高宁绳纪坡张勇更多>>
- 相关机构：军事医学科学院福建农林大学上海交通大学更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- TAFA2基因剔除小鼠模型的建立被引量：1
- 2010年
- 目的 建立TAFA2基因剔除小鼠模型,为在体研究TAFA2基因的生物学功能及其与中枢神经系统发生、发育的关系创造条件. 方法 运用生物信息学手段确定小鼠TAFA2基因组的序列,设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-MCS-TAFA2,以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆,PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆. 结果 同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚后获得嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti（野生型）毛色的小鼠41只,其中14只为TAFA2基因剔除杂合子小鼠,阳性率为34.1%.在雌、雄杂合子小鼠交配的后代中获得纯合子小鼠,初步的表型观察未发现TAFA2基因剔除小鼠出现异常改变. 结论 已成功建立了TAFA2基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.
- 孙莲花陈燕麻孙恺迟俊匡颖顾鸣敏王铸钢
- 关键词：基因剔除
- 肿瘤-睾丸抗原CT45-5的表达纯化及多克隆抗体的制备被引量：2
- 2009年
- 目的:原核表达、纯化肿瘤-睾丸抗原CT45-5基因,并制备多克隆抗体,以研究其在Fhit特异的信号通路中的作用。方法:设计出特异针对CT45-5的引物,通过RT-PCR扩增出CT45-5的编码基因,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果:原核表达和纯化了CT45-5,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的CT45-5蛋白。结论:肿瘤-睾丸抗原CT45-5能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究CT45-5的功能奠定了基础。
- 张勇张鸿声于芳绳纪坡高宁胡宝成
- 关键词：表达纯化多克隆抗体
- 脆性组氨酸三联体与复制蛋白A相互作用的鉴定被引量：4
- 2008年
- 目的:研究脆性组氨酸三联体(Fhit)对ATR/CHK1通路的影响,确定Fhit与复制蛋白A(RPA)存在相互作用,为进一步研究Fhit特异的信号通路奠定基础。方法:将Fhit全长基因插入含GST基因的原核表达载体中,在大肠杆菌中表达纯化GST-Fhit融合蛋白,并用GST沉降技术研究Fhit与RPA是否在体外存在相互作用;在表达Fhit的人细胞中用免疫共沉淀技术分析Fhit与RPA是否在体内存在相互作用,同时用免疫荧光染色方法研究Fhit与RPA在细胞内是否可以共定位。结果:通过免疫共沉淀、免疫荧光染色及GST沉降技术,确定了Fhit与RPA在体内及体外均可以相互作用。结论:确定了Fhit与RPA之间存在相互作用,为阐明Fhit在维持基因组完整性方面的机理提供了线索。
- 于芳绳纪坡张勇张鸿声高宁张宏达胡宝成
- 关键词：脆性组氨酸三联体蛋白质相互作用
- 黏蛋白1基因敲除小鼠模型的构建
- 2014年
- 黏蛋白1(MUC1)属黏蛋白家族成员,分布于上皮细胞膜表面,由于在免疫炎症反应以及肿瘤发生中的重要作用而日益受到重视.为了进一步深入研究MUC1的生物学功能,构建了Muc1基因敲除小鼠模型.首先,根据小鼠Muc1基因组序列设计基因剔除策略,将2个loxP位点分别插在外显子2和3两侧,构建基因剔除载体Muc1-ABRLFn-pBR322.以电穿孔方法将载体导入胚胎干细胞(ES细胞),用G418和更昔洛韦进行正负筛选获得4个同源重组的ES细胞克隆.挑选其中一个阳性ES克隆行囊胚显微注射,获得16只嵌合率大于50%的雄鼠;其次,利用嵌合雄鼠与C57BL/6J野生型雌鼠交配后获得11只floxP杂合子小鼠(10雄1雌),通过杂合子小鼠回交,并进一步与EⅡa-Cre小鼠交配,最终成功得到Muc1全身敲除小鼠,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.初步表型观察未发现Muc1基因敲除相关器官组织结构的异常改变.本研究为MUC1的生物学功能的挖掘,尤其是MUC1在肿瘤发生转移中的作用机制的揭示提供了实验平台.
- 程布凯杨杰茅文莹石吉晶靳伟廖晓东匡颖赵克温黄雷
- 关键词：黏蛋白1小鼠生物学功能
- 人MEPE基因稳定表达细胞系的建立及MEPE蛋白在DNA损伤应答中的功能初探被引量：1
- 2010年
- 目的构建人MEPE基因真核表达载体,稳定转染人胚肾293T细胞,并建立稳定表达细胞株;初步探讨人MEPE蛋白在DNA损伤应答中的作用。方法将人MEPEcDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建重组质粒;分别将载体pREP10/MEPE-HA和pREP10/HA转染293T细胞;经潮霉素B加压筛选阳性克隆;用RT-PCR和免疫印迹方法分别在RNA水平和蛋白水平鉴定稳定表达MEPE-HA融合蛋白的阳性细胞株;利用一定浓度的DNA损伤诱导剂喜树碱(camptothecin,CPT)处理细胞,通过MTT比色法检测不同时间点细胞存活率的变化,其趋势即可反映出不同细胞株对DNA损伤诱导剂的敏感性。结果经酶切鉴定及序列分析,人MEPE基因真核表达载体pREP10/MEPE-HA构建正确,转染人293T细胞,筛选出MEPE表达较高的细胞株,并且发现该基因的高表达可以使细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性提高。结论成功建立了稳定表达人MEPE的293T细胞株,并对人MEPE蛋白在细胞中对DNA损伤诱导剂敏感性的影响进行了初步探讨,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。
- 高宁绳纪坡于芳林宇翔马祖兴胡宝成
- 关键词：基因表达细胞系DNA损伤
- 脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA的构建及干扰效果检测
- 2010年
- 目的:构建脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对293T细胞内源性FHIT基因表达的干扰效果。方法:根据FHIT基因序列,通过生物信息学网站预测可能的siRNA,从中筛选出2条合理的FHIT-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer2.1-U6Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建成功的FHIT-siRNA重组载体转染人胚肾细胞293T,Western印迹检测siRNA对293T内源性FHIT表达的干扰效果。结果:构建了2个FHIT-siRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的作用效果可达50%以上。结论:构建的FHIT-siRNA为进一步研究FHIT的功能提供了有利的工具。
- 林宇翔于芳绳纪坡高宁马祖兴胡宝成
- 关键词：脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA
- 人MEPE/OF45基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2008年
- 目的:克隆人MEPE/OF45全长基因,为进一步研究MEPE/OF45在DNA损伤应答中的作用及特异的信号通路奠定基础。方法:选取人宫颈癌细胞HeLa为靶细胞,从中提取总RNA,设计扩增人MEPE/OF45基因片段的特异引物,进行RT-PCR分析;用蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮(CHX)对细胞进行处理,观察处理前后MEPE/OF45基因的表达情况。结果:在经CHX处理的HeLa细胞中扩增到了MEPE/OF45基因片段,随后利用重叠PCR方法获得了人MEPE/OF45全长基因,并经序列分析确证。结论:获得了人MEPE/OF45基因片段及全长基因,为阐明MEPE/OF45在细胞中复杂的功能提供了线索。
- 张鸿声高宁绳纪坡于芳张宏达张勇胡宝成
- 关键词：克隆HELA细胞
- 脆性组氨酸三联体与复制蛋白A相互作用关键氨基酸残基的鉴定被引量：4
- 2008年
- 目的:研究脆性组氨酸三联体(Fhit)对ATR/CHK1通路的影响,在确定Fhit与复制蛋白A(RPA)存在相互作用的基础上鉴定Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基,为进一步研究Fhit特异的信号通路奠定基础。方法:构建一系列Fhit缺失突变体基因Fhit1～Fhit11及6种Fhit点突变体基因,将这些基因插入含GST基因的原核表达载体中,在大肠杆菌中表达并纯化GST-Fhit1～GST-Fhit11融合蛋白、突变体GST-FhitSIYEEL、GST-FhitIY、GST-FhitEL、GST-FhitF、GST-FhitA,以及GST-FhitD融合蛋白,用GST沉降技术研究Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。结果:Fhit蛋白第112～117(SIYEEL)残基可能是Fhit与RPA相互作用的关键区域,而第114(Y)残基可能是Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。结论:确定了Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基,为阐明Fhit在维持基因组完整性方面的机理提供了线索。
- 张勇于芳张宏达绳纪坡高宁张鸿声胡宝成
- 关键词：脆性组氨酸三联体蛋白相互作用
- 大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2的表达、纯化及抗体制备被引量：1
- 2011年
- 目的:原核表达、纯化大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2(SERPINB2),并制备其多克隆抗体。方法:设计扩增大鼠Serpinb2全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果:原核表达了大鼠Serpinb2全长基因,纯化了SERPINB2蛋白,并获得了抗SERPINB2的多克隆抗体,抗体效价达到1:25600,Western印迹结果显示该抗体能特异识别原核及真核细胞表达的SERPINB2。结论:SERPINB2能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究SERPINB2的功能奠定了基础。
- 马祖兴高宁于芳林宇翔绳纪坡胡宝成
- 关键词：纯化多克隆抗体
- DNA损伤检查点蛋白调节子1片段的表达纯化及抗体制备
- 2009年
- 目的:原核表达、纯化DNA损伤检查点蛋白调节子1(MDC1)片段,并制备其多克隆抗体。方法:设计特异引物,通过RT-PCR扩增编码MDC1 N端194个氨基酸残基的基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果:原核表达并纯化了MDC1 N端片段,并获得了抗MDC1的多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹显示该抗血清能特异识别原核及真核细胞表达的MDC1。结论:MDC1 N端片段能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MDC1在Fhit特异信号通路中的作用奠定了基础。
- 高宁张勇于芳张鸿声绳纪坡胡宝成
- 关键词：多克隆抗体
