通过序列比对发现猪瘟病毒的强毒株和疫苗株在毒力基因Erns中存在两个差异氨基酸,据此在猪瘟病毒标准强毒sh im en株全长感染性cDNA克隆的基础上,(1)将疫苗株的Erns基因置换sh im en株的相应片段,构建嵌合型全长cDNA克隆;(2)对Erns基因进行定点突变,使293位和311位的丝氨酸和酪氨酸分别突变为天门冬氨酰和组氨酸,构建突变型全长cDNA克隆。用SacⅡ限制性内切酶将构建的全长cDNA线性化,体外转录获得基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至PK-15细胞系,连续传代,收集3代以后培养细胞,采用RT-PCR、间接免疫荧光法进行鉴定。结果表明,所构建的全长cDNA克隆不仅具有分子水平的忠实性,而且在细胞水平表现出了感染性。该研究为后续在动物水平上进一步阐明Erns基因的功能奠定基础。
