国家自然科学基金(30470394)
- 作品数：7 被引量：16H指数：2
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- 相关机构：大连医科大学辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室更多>>
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- 平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体对ATP酶活性的调节作用
- 2009年
- 目的:探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制。方法:利用编码MLCK全长的pColdI表达载体对其ATP结合位点进行定点突变,获得无激酶活性的MLCK突变体;应用Glycerol-PAGE鉴定肌球蛋白磷酸化水平;应用孔雀绿方法检测重组MLCK对肌球蛋白ATP酶活性的影响。结果:MLCK/△ATP(突变型)失去磷酸化肌球蛋白轻链的激酶活性;重组MLCK(野生型)和MLCK/△ATP(突变型)均可以在非钙条件下激活非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性,抑制磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性,而且激活与抑制作用均随着MLCK浓度的增加而增大,但二者对肌球蛋白的ATP酶活性的作用没有显著差异(P>0.05)。结论:平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体具有激活非磷酸化肌球蛋白ATP酶活性的作用。
- 崔颖谢策吕广艳王辉赵莹魏晓晴曲淑贤曹晶萍高颖
- 关键词：平滑肌收缩肌球蛋白
- 重组平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体的构建及表达
- 2009年
- 目的构建重组全长平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)ATP结合位点突变体,以研究平滑肌MLCK的结构与功能。方法利用试剂盒对MLCKATP结合位点进行定点突变,构建全长平滑肌MLCKATP结合位点突变体重组表达载体pCold/BsMLCK/△ATP,在大肠杆菌中表达;利用SDS-PAGE鉴定表达的重组全长平滑肌MLCKATP结合位点突变体在细胞中的分布;运用亲和层析及凝胶过滤分离纯化重组全长MLCK并利用SDS-PAGE鉴定表达MLCK的纯度。结果重组全长MLCK/△ATP(突变型)在大肠杆菌中以可溶的形式大量表达;在样品的上清和沉淀中均有重组全长MLCK/△ATP表达;经CaM-Sepharose4B和Superose6HR纯化,SDS-PAGE鉴定得到单一的表达条带。结论重组全长MLCK/△ATP(突变型)可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达;SDS-PAGE结果显示重组全长MLCK/△ATP可以通过亲和层析和凝胶过滤纯化得到单一的条带。
- 崔颖谢策魏晓晴赵莹吕广艳王辉高颖
- 关键词：MLCK突变体
- 平滑肌肌球蛋白轻链激酶N端删除载体的构建
- 2009年
- 目的:构建重组平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)N端删除载体,为研究平滑肌MLCK的分子机制提供研究模型。方法:以重组质粒pCold/155为模板,根据其待删除序列(N端1-41个氨基酸)设计上下游引物,行PCR扩增。将扩增片段以Nde I/EcoR I双酶切,产物行琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因。将目的基因与载体连接,转化至大肠杆菌。筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行测序。结果:用Nde I和EcoR I双酶切重组质粒pCold/155,琼脂糖凝胶电泳显示得到约4.4kb载体和约3.4kb的MLCK片段。阳性克隆经测序证实MLCK的N端41个氨基酸序列已被成功删除。结论:成功构建了重组MLCK N端删除载体pCold/155/D41。
- 吕广艳崔颖于守鹏陈海波曲淑贤高船舟高颖
- 关键词：肌球蛋白轻链激酶肌动蛋白
- 肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建
- 2009年
- 目的:平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用。为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,本实验利用分子生物学技术构建了肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体,并纯化出重组的MLCK表达的蛋白质,为深入研究MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制提供了实验基础。方法:利用野生型MLCK全长的cDNA序列设计CaM结合位点的突变引物,利用PCR技术进行定点突变,获得CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK)。在大肠杆菌中表达重组CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK),通过亲和层析及凝胶过滤进行分离纯化重组蛋白,SDS-PAGE检测表达及纯化的重组蛋白。结果:构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK),△CaM/MLCK在大肠杆菌中以可溶形式大量表达并得到纯化。结论:成功构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK)并获得纯化的表达蛋白质。
- 魏晓晴张月赵莹吕广艳崔颖王辉高颖
- 关键词：肌球蛋白轻链激酶钙调蛋白突变体
- Ca2+/CaM调节平滑肌肌球蛋白轻链激酶非激酶活性研究
- 肌球蛋白轻链激酶（MLCK）在有Ca2+与钙调蛋白(Ca2+/CaM)存在的情况下磷酸化肌球蛋白20KD调节轻链,从而使肌球蛋白与肌动蛋白之间相互作用。此外,MLCK还具有非激酶活性,在用肌球蛋白包被的盖玻片上我们观察到...
- 张月赵莹崔颖魏晓晴高颖
- 关键词：MLCK肌球蛋白肌动蛋白
- 文献传递
- 肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体对肌球蛋白ATP酶活性的影响
- 2009年
- 目的:探讨肌球蛋白轻链激酶(MLCK)钙调蛋白(CaM)结合位点突变体对肌球蛋白ATP酶活性的影响。方法:构建牛胃重组全长野生型MLCKCaM结合位点突变型蛋白(△CaM/MLCK);孔雀绿方法检测△CaM/MLCK对肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影响。结果:在无Ca2+/CaM存在时,随着△△CaM/MLCK浓度的增加,非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显增加;而磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显降低。结论:△CaM/MLCK对肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响表明MLCK具有非激酶活性。
- 赵莹张月吕广艳王辉崔颖魏晓晴陈海波高颖
- 关键词：MLCK肌球蛋白ATP酶活性
- 平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP酶活性的调节被引量：7
- 2007年
- 肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,以进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制.采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6·5/D,经大肠杆菌表达得到可溶性GST融合蛋白,利用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达的MLCK在细胞中的分布,结果还显示,提取液的上清和沉淀中均有MLCK片段的表达.运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的MLCK片段(F6·5和F6·5/D),经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B纯化,SDS-PAGE鉴定显示为单一表达条带.应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响.两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用,并随MLCK浓度的增加,酶的活性增加.比较删除前后不同MLCK片段对ATP酶活性的影响结果显示,删除MLCK片段1002位丙氨酸至1019位亮氨酸后,对ATP酶的激活作用较删除前明显降低,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的区域.利用电镜技术观察到MLCK片段(F6·5)使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化.加入MLCK片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型,并且MLCK片段还具有促进肌球蛋白单体形成肌丝的作用.
- 崔颖李晓丽梁明丽陈海波高颖
- 关键词：平滑肌收缩肌球蛋白轻链激酶肌球蛋白
- 肌球蛋白轻链激酶非激酶活性调节磷酸化肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动被引量：15
- 2008年
- 肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为进一步阐明MLCK非激酶活性在平滑肌收缩过程中的调节作用,利用已删除部分激酶区域的MLCK重组体(pGEX-F6.5)在大肠杆菌中进行表达,采用亲和层析技术纯化表达的MLCK片段,应用EnzChek磷分析试剂盒检测MLCK片段对磷酸化肌球蛋白、水解重酶解肌球蛋白(heavy meromyosin,HMM)及肌球蛋白亚片段1(subfragment1,S1)ATP酶活性的影响,体外检测MLCK片段对肌动蛋白肌丝运动的调节.研究结果显示,pGEX-F6.5重组表达载体在大肠杆菌中以可溶性GST融合蛋白的形式表达.该融合蛋白经Glutathione-Sepharose4B纯化、SDS-PAGE鉴定得到较纯的单一表达条带.纯化的MLCK片段对磷酸化肌球蛋白、HMM和S1的ATP酶活性均有明显激活作用.MLCK片段激活磷酸化肌球蛋白ATP酶活性为:Vmax=(19.426±1.669)倍;Km=(0.486±0.106)μmol/L,MLCK片段对磷酸化HMM和S1的ATP酶活性也有相似的刺激作用.体外肌丝运动研究表明,随着MLCK片段浓度的增加,磷酸化肌球蛋白与肌动蛋白结合的数量不断增加,肌丝运动的速度也随之增加.上述结果表明,MLCK的C端非激酶活性具有调节磷酸化的肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动的作用.
- 梁明丽崔颖吕广艳高颖
- 关键词：平滑肌收缩肌球蛋白
