国家自然科学基金(81273126)
- 作品数：16 被引量：33H指数：3
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- 基于定量蛋白质组学技术的铬致细胞恶化转化中SET的潜在作用分析
- 2019年
- 目的分析六价铬[Cr(Ⅵ)]诱导人支气管上皮样细胞(16HBE细胞)恶性转化中蛋白表达谱改变及差异蛋白SET的表达水平,为研究Cr(Ⅵ)致癌的分子机制提供新的线索.方法以Cr(Ⅵ)诱导恶性转化的16HBE细胞为研究对象,提取总蛋白并经烷基化、脱盐,最后酶解为肽段,用Tandem Mass Tag(TMT)进行标记,利用液相色谱-电喷雾质谱(LC-ESI-MS/MS)对标记肽段进行鉴定及相对定量;通过Western blot验证差异表达蛋白SET,并检测其下游分子的表达水平.利用在线分析网站Https://david.ncifcrf.gov对差异蛋白进行基因富集分析.结果 LC-ESI-MS/MS共鉴定3 517个蛋白,上调蛋白185个、下调蛋白201个;基因富集分析发现,差异蛋白主要参与细胞自噬、DNA损伤修复、RNA加工等多个生物学过程;Western blot结果显示,与对照组比较,SET蛋白表达水平上调(P<0.05),SET下游分子H3K18ac、H3K 27ac和p53的表达水平均呈下降趋势,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 Cr(Ⅵ)诱导16HBE细胞恶性转化过程中涉及多个生物学过程的蛋白发生改变,SET可能通过抑制H3K18ac、H3K 27ac水平介导p53转录活性的调控模式在Cr(Ⅵ)致癌中发挥重要作用.
- 陈志鸿陈志鸿任晓虎任晓虎黄超刘云岗刘云岗
- 关键词：定量蛋白质组学
- 高效液相色谱-串联质谱检测基因组DNA甲基化方法的建立被引量：2
- 2014年
- 目的：建立高效液相色谱-串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）检测基因组DNA甲基化水平的方法。方法：以5-mdC和dG为标准品，采用全自动高效液相色谱系统进行分离，串联电喷雾质谱检测，选择多反应监测模式（MRM）测定标准品，绘制标准工作曲线。结果：在MRM模式下选取5-mdC（m/z 241.9→126.3）和dG（m/z 268.1→152.3）分别作为定量检测的母子离子对，各化合物能实现良好的基线分离；5-mdC和dG碰撞能均为15 eV，去簇电压分别为40和45 V，最低定量限分别为1.65和2.47 fmol；标准品的响应值比为90%~110%；5-mdC含量的天内相对标准偏差和天间相对标准偏差均小于8%。结论：HPLC-ESI-MS/MS是能应用于检测基因组DNA甲基化的一种高通量、高准确率、高分辨率、高灵敏度且重复性好的方法。
- 张航胡俊杰汤瑞华叶金波任晓虎胡韬黄培武杨细飞黄海燕刘建军
- 关键词：高效液相色谱串联质谱DNA甲基化
- 三氯乙烯肝细胞毒性机制及生物标志物
- 目的 探讨三氯乙烯(TCE)的肝细胞毒性机制,以及筛选TCE相关的生物标志物。方法 运用2DE联合MALDI-TOF-TOF/MS鉴定差异蛋白,选择差异蛋白SET,联合使用Pull-Down串联亲和层析、液相色谱-串联质...
- 刘建军任晓虎黄培武洪文旭杨细飞黄海燕
- SET缺陷对三氯乙烯诱导L-02细胞增殖和凋亡及组蛋白去乙酰化酶的影响
- 2016年
- 目的比较三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）诱导人正常肝细胞（L-02细胞）和SET基因缺陷L02细胞（SET缺陷细胞）中细胞增殖、凋亡、组蛋白去乙酰化酶活力及表达水平的变化，探讨TCE染毒对组蛋白修饰的影响及SET在表观遗传调控中的作用。方法选用前期建立的SET缺陷细胞为研究对象，以未经TCE处理的L-02细胞和SET缺陷细胞作为各自的对照组，用2．00和8．00mmol／LTCE染毒两种细胞24h，用CCK．8法和Hoechst 33342染色法检测细胞的增殖水平和凋亡率。用0．25、0．50、1．00、2．00、4．00、8．00mmol／LTCE染毒两种细胞，检测细胞的组蛋白去乙酰化酶活力和蛋白去乙酰化酶的蛋白表达水平。结果TCE8．00mm01]L染毒组SET缺陷细胞与L-02肝细胞比较，增殖水平呈下降趋势，凋亡率呈上升趋势，且差异均有统计学意义（t值分别为-4．362和23．950，P〈0．05）。TCE处理L-02肝细胞和SET缺陷细胞后均引起细胞增殖水平的下降和凋亡率的升高，当TCE浓度达到8．00mmol／L时，两组细胞间的增殖水平和凋亡率的差异有统计学意义（t值分别为-4．362，和23．950，P值均小于0．05）。使用0，0．25，0．50，1．00，2．00，4．00和8．00mmol／L TCE处理L-02细胞和SET缺陷细胞24h后，两种细胞的组蛋白去乙酰化酶活力水平均呈现上升趋势。其中，当TCE染毒浓度到达0．50mmol／L时，与L-02细胞对照组比较，L-02细胞组组蛋白去乙酰化酶活力明显升高，差异有统计学意义（F值为403．26，P〈0．01）；TCE为1．00mmol/L时酶活力最高。与SET缺陷细胞对照组比较，当TCE达到1．00mmol/L时，SET缺陷细胞组蛋白去乙酰化酶活力明显升高，差异有统计学意义（F值为44．01，P〈0．01）。与同染毒剂量的L-02细胞比较，当TCE染毒剂量到达0．50mmol／L时，SET缺陷细胞的组蛋白去乙酰化酶活力均低于L-02细胞，差异有统计学意义（P〈
- 谢光珊刘建军洪文旭张航孙烨朱卫国
- 关键词：三氯乙烯组蛋白脱乙酰基酶人正常肝细胞
- 职业性三氯乙烯药疹样皮炎诊断模型的建立被引量：1
- 2013年
- 目的应用弱阳离子交换磁珠（magneticbeadsbasedweakcationexchangechromatography，MB—WCX）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix—assistedlaserdesorptionionizationtime—of-flightmassspectrometry，MALDI—TOF—MS）和ClinProTools生物信息学方法检测职业性三氯乙烯药疹样皮炎（occupationalmedicamentosa—likedermatitisinducedbytrichlor（1ethylene，OMLDT）患者的血清多肽指纹图谱，建立OMLDT诊断模型。方法收集2009年12月至2010年10月经深圳市职业病防治院诊断的OMLDT患者和对照人群血清样品各28份，选取其中的患者和对照人群血清样品各14份作为建模组，采用MB—WCX联合MALDI—TOF—MS技术检测血清多肽指纹图谱，筛选OMLDT特征性多肽标志并建立OMLDT疾病蛋白质组学诊断模型。用其余的14份患者和14份对照人群的血清样作为验证组，评价模型的准确度和识别率。结果应用ClinProTools软件，共得到159个峰，33个为有统计学意义的峰（P〈0．05）。其中，相对于对照组，建模组的病例组中有20个峰表达降低，有13个表达增高。采用监督神经网络算法（supervisedneuralnetworkalgorithm，SNN）对多肽峰进行筛选，质荷比（m／z）为2106．29和3263．78的2个多肽峰受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC）的下面积（TheareaundertheROCcurve，AUC）最接近1，最能区分病例组和对照组，2D分布图上也能明显区分，选择这2个多肽峰构建OMLDT的诊断模型。诊断模型的交叉验证和识别能力分别是87．5％和98．5％，灵敏度和特异度分别为84．8％和82．1％。结论应用MB—WCX、MALDI—TOF—MS技术结合ClinProTools软件首次对OMLDT建立诊断模型并验证，筛选到了特异性差异多肽，具备较高的灵敏度和特异度，为临床早期诊断提供了科学依据。
- 叶金波刘威周桂凤任晓虎黄培武洪文旭黄海燕刘建军
- 关键词：三氯乙烯皮炎
- 三氯乙烯致肝细胞毒性中SET启动子区甲基化水平的改变
- 2018年
- 目的研究三氯乙烯（Trichlorethylene，TCE）致肝细胞毒性中SET基因启动子区甲基化水平的改变。方法培养L—02肝细胞，使用0、1、2、4、8mmol／L浓度的TCE处理24h，提取细胞基因组DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，用PCR扩增目标序列，重亚硫酸氢盐测序法（t3sP）分析TCE作用下肝细胞中SET基因启动子区甲基化状态。结果与对照组比较，TCE处理后L-02肝细胞中SET基因启动子区甲基化水平下降，且随着TCE染毒浓度的增加，SET基因启动子区甲基化水平递减。对SET启动子区甲基化差异位点进行分析发现，差异有统计学意义的甲基化位点有73个，已知转录因子结合位点9个。结论TCE致L-02肝细胞毒性中SET基因启动子区甲基化水平下降，影响转录因子的结合，继而使SET蛋白表达升高。
- 阮嘉雯陈志鸿陈志鸿张航张航任晓虎黄新凤袁建辉刘云岗
- 关键词：三氯乙烯L-02肝细胞DNA甲基化
- 三氯乙烯对人正常肝细胞组蛋白质甲基化修饰影响的研究被引量：3
- 2017年
- 目的 筛选三氯乙烯（TCE）诱导的人正常肝细胞（L-02细胞）组蛋白异常甲基化修饰,并探讨其在三氯乙烯致肝细胞毒性中的可能作用.方法 以0、8.0 mmol/L的TCE处理L-02细胞24 h,采用酸法提取组蛋白,通过液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）鉴定和定量分析组蛋白差异甲基化修饰水平,以Western blot验证组蛋白H3K79二甲基化（H3K79 me2）及H3K79三甲基化（H3K79 me3）修饰水平,检测相对表达量.使用单细胞凝胶电泳检测细胞的DNA损伤水平.采用Western blot检测p53与H2AX的磷酸化修饰（？H2AX）的相对表达量.结果 TCE处理L-02细胞24 h后,质谱鉴定出28个肽段的36个表达有差异的组蛋白甲基化位点;L-02细胞经0、8.0 mmol/L TCE处理后,组蛋白H3K79 me3的相对表达量分别为1.00±0.06、0.70±0.09（t=15.01,P=0.015）;组蛋白H3K79 me2的相对表达量分别为1.00±0.05、0.74±0.07（t=16.69,P=0.018）;DNA损伤的Olive尾距值分别为1.46±0.28、3.12±0.68（t=15.22,P=0.018）;蛋白p53的相对表达量分别为1.00±0.04、1.24±0.04（t=18.71,P=0.012）;？H2AX的相对表达量分别为1.00±0.03、1.56±0.11（t=8.32,P=0.045）.结论 TCE引起L-02细胞组蛋白中H3K79 me2与H3K79 me3修饰水平发生变化,并且诱导DNA损伤,提示TCE可能通过DNA损伤导致H3K79 me2和H3K79 me3甲基化修饰的变化.
- 邓荣霞任晓虎阮嘉雯郑剑钟佳成卢维雪邹晓青刘建军
- 关键词：三氯乙烯组蛋白类DNA损伤修复
- SET基因缺陷对三氯乙烯诱导人正常肝细胞DNA甲基化水平改变的影响被引量：2
- 2015年
- 目的比较三氯乙烯（trichloroethylene）诱导人正常肝细胞（L-02细胞）和SET基因缺陷L-02细胞（SET缺陷细胞）中DNA甲基化相关指标的变化，探讨SET与三氯乙烯诱导的表观遗传调控作用之间的关系。方法选用前期建立的SET缺陷细胞为研究对象，使用三氯乙烯分别对L一02细胞和SET缺陷细胞进行处理，检测细胞增殖水平、细胞DNA甲基化水平和DNA甲基转移酶（DNAmethvltrans伯rases，DNMTs）活性的变化，通过Westernblot法从蛋白水平分析DNMTs（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）的表达变化。结果三氯乙烯处理L-02细胞和SET缺陷细胞24h后，两种细胞的增殖水平均呈现下降趋势。使用0、1．0、2．0、4．0和8．0mmol／L的三氯乙烯处理细胞后，L-02细胞的相对增殖水平分别为100．00±2．70、83．34±2．38、75．56±4．51、71．67±2．77、66．67±1．63（F=58．29，P〈0．001）；SET缺陷细胞的相对增殖水平分别为101．12±1．67、85．01±2．33、79．44±1．67、78．337±3．89、76．11±3．33（F=42．41，P〈0．001）。0、1．0、2．0、4．0和8．0mmol／L的三氯乙烯处理L-02细胞和SET缺陷细胞24h后，L-02细胞的DNA甲基化水平分别为3．77±0．08、3．48±0．08、3．38±0．10、3．14±0．15、2．91±0．07，呈下降趋势（F=212．87，P〈0．001）；SET缺陷细胞DNA甲基化水平分别为3．77±0．15、3．57±0．15、3．30±0．11、3．35±0．13呈下降趋势（F=79．32，P〈0．001）。L-02细胞经0、1．0、2、0、4．0、8．0mmol／L的三氯乙烯处理24h后，DNMTI蛋白的相对表达量分别为1．00±0．03、1．28±0．04、1．20±0．04、1．62±0．05、1．43±0．04，表达升高（F=103．00，P〈0．001）；而在SET缺陷细胞中DNMT1的相对表达量分别为1．00±0．04、0．96±0．02、1．19±0．05、0．85±0．03、0．83±0．03，出现下降（F=44．18，P〈0．001）。结论SET缺陷可以明显抑制三氯乙烯暴露引起的L-02�
- 洪文旭黄爱博许华张航王宏菊赵琼晖叶金波刘建军
- 关键词：人正常肝细胞DNA甲基转移酶
- Pri-miRNA21/23a重组病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达鉴定
- 2017年
- 目的:构建Pri-miRNA-21/23A基因的重组病毒载体,并在L-02肝细胞中获得表达。方法:设计并合成Pri-miRNA-21/23a的基因产物,插入含绿色荧光蛋白Zsgreen基因的真核表达载体pCI Mamma Lian中,以重组质粒为模板,设计扩增含Zsgreen基因的Pri-miRNA序列产物,并将其与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体连接,将Pri-miRNA重组病毒载体转染293T细胞后进行病毒包装,病毒上清转染L-02肝细胞后用荧光显微镜及实时荧光定量PCR确认转染效果。结果:荧光定量PCR结果显示重组病毒上清转染L-02肝细胞感染效果良好,经荧光显微镜观察,证实重组病毒载体能在细胞中表达蛋白。结论:构建了Pri-miRNA21/23a重组病毒表达载体并在L-02肝细胞中表达,奠定了miRNA进一步功能研究的基础。
- 钟佳成张航任晓虎卢维雪胡盼盼刘建军
- 关键词：MICRORNAMIR-21慢病毒表达载体
- 质谱技术在DNA甲基化研究中的应用被引量：1
- 2015年
- DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰之一,主要发生在哺乳动物基因组Cp G核苷酸序列中的胞嘧啶C-5位点,并与机体生长发育、转座子沉默、X染色体失活及许多疾病的发生相关。但对DNA甲基化的形成、维持和重构的分子机制的认识是有限的,需要从基因组水平寻找最优的DNA甲基化定性和定量分析方法,而质谱技术以高敏感性、高通量、高准确率、高分辨率、快速且重复性好等优势在该研究领域具有较大的应用价值。介绍质谱技术在全基因组DNA甲基化和启动子区甲基化分析中的应用。
- 黄新凤叶金波刘建军
- 关键词：启动子区甲基化质谱液相色谱
