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Kininogen及其在鱼类中的研究进展: 2016年; 本文首先介绍了半胱氨酸蛋白酶抑制因子超家族中kininogen(家族III)及其各结构域的功能。在此基础上,阐述了鱼类kininogen在分离纯化、活性和结构特征的研究进展。最后,分析探讨了鱼类kininogen在食品、医药领域的应用前景,并展望了鱼类加工下脚料中kininogen的开发利用方向。; 李松徐建俊伍发芬李彪刘玲蒋然然李树红; 关键词：纯化鉴定结构特征

鲢鱼和草鱼下脚料中CPIs抑制活性比较及其分子量分布的鉴定被引量：4: 2014年; 本研究首先确定偶氮酪蛋白（Azocasein）法和荧光合成肽法测定CPIs抑制活性的适宜反应体系,并证实Azocasein法更适合在鲢、草鱼下脚料（卵、皮）粗提过程中监测CPIs的抑制活性,而在层析过程中需采用高灵敏度的荧光合成肽法。Azocasein法测定表明,草鱼卵（349600units、332units/mg）和皮（25600units、87units/mg）中总活和比活均分别显著高于鲢鱼卵（10620units、3.98units/mg）和皮（3726units、14.14units/mg）;同时,草鱼卵中CPIs抑制总活、比活均高于皮;鲢鱼卵中CPIs抑制总活高于皮,但抑制比活则低于皮;此外,根据Sephacryl S-200分子筛层析中活性峰位置,初步判断两种鱼卵和皮组织中均存在高（50~128ku）、低（7~19ku）分子量形式的CPIs,但明胶底物-SDS-PAGE反相酶谱中仅可见高分子CPIs形成的条带,而小于20ku的低分子CPIs均无法得到鉴定。; 李树红陈海蒋然然李美良李艳芳吴睿姜海洋肖安蓬何杰; 关键词：鲢鱼草鱼下脚料抑制活性分子量分布

鲢鱼肝脏中高分子CPIs提取方法的建立及其鉴定: 2018年; 研究了不同浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)、热处理条件及pH值对鲢鱼肝脏中高分子半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)提取过程中的作用,根据其对CPIs在TSK液相上高分子质量部分的蛋白峰值和比活力(荧光合成肽底物法)的影响,确定了最佳粗提条件为:以含5 mmol/L的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),100mmol/L的Tris,3 mmol/L的EDTA(pH 7.5)作为提取缓冲液,而后在pH 8.7碱处理条件下经90℃加热5 min后,再回调到pH 7.0。用该法制备的鲢鱼肝脏CPIs粗提物经制备型Sephacryl S-200分子筛层析,分离得到的高分子活性部分,进一步经过反相酶谱法鉴定得到一种高相对分子质量的活性CPI,推测其可能是与某些蛋白结合形成了复合物,或是高分子CPIs的二聚体形式。; 蒋然然钟海霞但静陈治光李冉蒋光阳杨娟李美良李树红; 关键词：半胱氨酸蛋白酶抑制剂高分子

饲料中苏氨酸含量对建鲤肉质及组织蛋白酶B、L的影响被引量：5: 2019年; 该试验测定了饲料中3组苏氨酸含量,即7.4 g/kg(缺乏组)、15.7 g/kg(适宜组)、25.2 g/kg(过量组),对建鲤肉质及组织蛋白酶B、L的影响。通过利用显微镜图像分析各处理组肌纤维特征、鱼肉品质指标,荧光合成肽底物法测定组织蛋白酶B(cathepsin B,CTS B)、组织蛋白酶L(Cathepsin L,CTS L)的活性,免疫组化法测定蛋白表达量,研究发现,饲喂90 d后,适宜组的肌纤维密度最高,肌纤维平均直径(22.12μm)最小;肌原纤维耐折力(0.1163μm)相对较高,而其断裂指数(A540=59.70)最低;剪切力(0.1684 kg·f)最高,失水率(21.02%)最低,p H值(6.91)最低;组织蛋白酶B、L的酶活性及表达量最低。综上,饲料中添加适宜水平苏氨酸能够改善鱼肉肌纤维特性及硬度品质,为通过营养素水平调节而提高建鲤鱼肉品质提供一定理论依据。; 白稚子刘明宇李树红林昊林灵李冉陈治光陈秀华; 关键词：建鲤肌纤维特性鱼肉品质组织蛋白酶

鲢鱼重组Cystatin的原核表达、鉴定及对铜绿假单胞菌的抑制作用被引量：10: 2014年; 本实验主要对鲢鱼半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并研究重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果。首先用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导转入p ET-30-Cystatin的E.coli BL21(DE3)表达重组Cystatin蛋白,经Ni2+-NTA镍离子亲和层析对其进行纯化,该重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示单一条带,分子质量约20.6 k D,在TSK-GEL G2000SW凝胶过滤高效液相色谱上呈单一活性峰,纯度为94.27%,经标准曲线计算其分子质量为20.9 k D;其次,利用抑制剂滴定曲线法,以偶氮酪蛋白为底物,确定重组Cystatin对木瓜蛋白酶(45.375μmol)的一个抑制活性单位为0.718μg;最后通过滤纸片扩散法鉴定鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果,结果表明Cystatin的添加量为20、60、120、200 U/片时,抑菌圈直径分别为8、9、13、26 mm。鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果呈剂量依赖关系。; 陈海姜海洋吴睿肖安蓬何杰李冉马璐阳任阳阳李树红; 关键词：半胱氨酸蛋白酶抑制剂鲢鱼原核表达铜绿假单胞菌抑菌活性

Raw264.7细胞向破骨细胞分化诱导培养体系的改良被引量：2: 2014年; 目的:通过改良细胞培养方案建立体外诱导Raw264.7细胞分化形成成熟破骨细胞(OC)的高效培养体系。方法:向Raw264.7细胞培养液α-MEM中添加50μg·L-1 M-CSF、100μg·L-1 RANKL和1×10-8 mol·L-1 1α,25-(OH)2D3,于5%CO2、37℃孵箱中培养12d,每3d换液1次,每次换液前对细胞进行短暂消化。倒置显微镜下观察细胞形态变化,并利用HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、FITCphalloidin染色和免疫荧光染色鉴定OC是否成熟并具有吞噬功能。结果:通过改良培养方法,在诱导过程中培养孔内的大部分区域始终保持单层细胞的生长状态。镜下观察和HE染色,诱导第12天时OC胞体覆盖培养面积的70%;FITC-phalloidin染色,伴随着OC成熟,伪足内出现的束状伪足小体逐渐变为环形,最终融合带状肌动蛋白环环绕在胞质周围;免疫荧光染色,诱导12d后OC表达的降钙素受体(CTR)较前体细胞显著增加,TRAP染色显示OC胞浆内呈现大量红色颗粒。提示获得的OC成熟并具有吞噬功能。结论:本实验通过改良培养方法,联合应用细胞因子50μg·L-1 M-CSF、100μg·L-1 RANKL和1×10-8 mol·L-1 1α,25-(OH)2D3建立了体外诱导Raw264.7细胞分化形成成熟OC的高效培养体系。; 李新张舒岩杨立彬李冉蒋然然陈治光李树蕾李树红; 关键词：RAW 破骨细胞巨噬细胞集落刺激因子核因子ΚB受体活化因子配体

4℃下鲢鱼重组Cystatin稳定性分析: 2015年; 重组鲢鱼Cystatin是一种具有明显抑菌活性的半胱氨酸蛋白酶抑制因子,研究其在4℃冷藏条件下的稳定性,可为未来将Cystatin蛋白应用于食品保藏、加工奠定必要的理论和实验基础.本文首先确定鲢鱼重组Cystatin的抑制活性单位,并研究其在4℃贮藏不同时间内的活性变化趋势;同时,分别采用Tricine-SDS-PAGE和Gelatin-Substrate-Active Tricine-SDS-PAGE及凝胶过滤高效液相色谱法,监测该重组Cystatin蛋白的分子降解情况.结果显示:重组0.18 mg/m L(即25 unit/m L)的Cystatin蛋白在4℃、p H=7.0条件下贮存15 d,活性几乎无损失且未发生降解,主要为Mr 20×103蛋白形式;17-21 d内逐步降解为Mr 14×103,但21 d时Cystatin抑制活性仍保持在80%以上;33 d时活性则迅速下降50%,Mr20×103的Cystatin蛋白完全降解,即液相检测图谱中峰2消失,有活性的Mr 14×103形式即峰3降解成低活性的Mr 12.55×103的峰3′,同时降解峰4、峰5、峰6即Mr 6.5×103、Mr 4×103左右的小肽片段比例快速升高,标志Cystatin明显失活.本研究表明,鲢鱼重组Cystatin蛋白在p H=7.0的液体环境中,4℃冷藏稳定性良好,活性及其完整性可保持约30 d.; 马璐阳蒋然然陈治光陈海李冉但静钟海霞李树红; 关键词：鲢鱼稳定性降解

鲢鱼卵中低分子CPIs的纯化鉴定及改善鱼糜凝胶强度的效果研究被引量：5: 2014年; 通过比较鲢鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)粗提过程中的比活力(Azocasein法),确定其最佳粗提条件为:以含0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)作为匀浆缓冲液,并于30℃对匀浆样进行pH 3.0酸处理10 min,然后碱回调至pH 8.0,CPIs纯度提高了15.54倍。进一步经SP Sepharose Fast Flow阳离子层析验证表明,与pH 4.0相比,pH 3.0酸处理能高效除去活性峰Ⅱ中的酸碱及热不稳定杂蛋白,使CPIs比活力提高了48.22倍。采用Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化的低分子CPIs组分Ⅱ-b和Ⅱ-c,比活力和纯化倍数分别为1 098.59 U/mg、312.10倍和1 769.23 U/mg、502.62倍。电泳分析表明,明胶底物-SDS-反相酶谱法无法鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c的抑制活性;而与木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)则初步鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c中均含有至少7 kD和10 kD两种低分子CPIs。最后经质构分析表明,Ⅱ-b和Ⅱ-c以5 U/g添加入鲢鱼鱼糜时,均能够极显著提高鲢鱼鱼糜凝胶强度(48.77%和55.55%),抑制软化。; 刘玲蒋然然彭海鑫李艳芳任阳阳肖安蓬陈海李树红; 关键词：纯化

鱼类Cystatins及其在水产食品中的应用前景被引量：1: 2013年; 本文综述了鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatins超家族的分类、结构及抑制机制,进一步根据其特性,提出Cystatin有望成为鱼肉品质相关候选因子,并且阐述了其在抑制鱼糜凝胶软化及水产品抑菌、保鲜等方面的应用前景。; 任阳阳李艳芳刘玲徐艺芮李树红; 关键词：水产食品

鲢鱼卵高分子质量CPI-I的纯化与鉴定被引量：13: 2012年; 以鲢鱼卵为材料制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)的粗提浓缩液,进而经Q Sepharose Fast Flow阴离子层析和Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化了的CPI-I。以偶氮酪蛋白(azocasein)法监测粗提液及层析纯化中CPIs的抑制活性。层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)法监测洗脱物的CPIs抑制活性的热稳定性。最终鲢鱼卵CPI-I被纯化了72倍,酶回收率为10.25%。利用Sephacryl S-200分子筛层析Marker标准曲线以及反相酶谱法,初步判断CPI-I的分子质量为89kD。高碘酸-Schiff试剂(PAS)染色法证明该蛋白为糖蛋白。CPI-I能够抑制鲢鱼组织蛋白酶L,且具有显著的热稳定性。; 宋川李艳芳任阳阳李树红; 关键词：纯化

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