江苏省自然科学基金(BK2001211)
- 作品数：3 被引量：14H指数：1
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- 抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段的构建和表达
- 2007年
- 目的:通过基因工程技术构建和表达抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段。方法:从分泌鼠抗人CD154单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4F1中提取总RNA,分别采用特异性引物扩增mAb VH和VL的DNA编码区基因。同时,从人脾脏细胞中克隆出免疫球蛋白恒定区基因。利用基因重组技术构建嵌合Fab共表达载体pTXB1-Fab,利用大肠杆菌表达简单,高效,成本低廉的特点,对重组Fab进行原核表达。利用SDS-PAGE电泳、Western blot、流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI数据库BLAST显示,克隆的基因序列符合小鼠Ig可变区特征。表达质粒pTXB1-Fab构建正确,在大肠杆菌中实现可溶性表达。表达的人-鼠嵌合抗体与亲本抗体具有相同的识别位点。结论:成功地克隆获得阻断型抗人CD154 mAb(4F1)的轻链、重链可变区基因,成功构建pTXB1-Fab共表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,为人源化抗体的制备奠定了技术基础。
- 葛彦陈永井瞿秋霞张学光
- 关键词：单克隆抗体CD154FAB
- 抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建及其表达被引量：13
- 2006年
- 目的:通过基因工程抗体改造技术构建并表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体。方法:从分泌鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株(5C11)中提取总RNA,用一对特异性引物通过RT-PCR扩增mAbVH和VL的DNA编码区基因。根据序列分析的结果,设计引物扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术,将mAb5C11的VH、VL基因及其相应信号肽序列与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/h5C11。用脂质体法将其导入293T细胞株中进行瞬时表达。利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI基因数据库Blast的结果显示,克隆的基因序列符合小鼠VH、VL基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pIRES/h5C11的构建正确,并在293T细胞株中获得瞬时表达。表达的抗人CD40的人-鼠嵌合抗体和mAb5C11具有相同的抗原结合位点。结论:成功地克隆了鼠抗人CD40mAbV区编码基因,并实现了可溶性抗人CD40的人-鼠嵌合抗体在293T细胞中的瞬时表达。
- 瞿秋霞陈永井葛彦王勤陈成杨明峰张学光
- 关键词：单克隆抗体嵌合抗体CD40
- 人源化抗体构建过程中假链的产生及应对策略被引量：1
- 2006年
- 目的在人源化抗体构建过程中,采用方便、快捷的分子克隆手段,消除SP2/0内源性畸形轻链转录本以获得正确的轻链cDNA。方法在mRNA抽提时,不用常规的TRIZOL法抽提总RNA,而采用经腹腔培养,生长状态良好的杂交瘤细胞,用QIAGEN公司Oligotex Direct mRNA Purification Kit,将polyA+的mRNA富集。可有效减少畸变转录本的含量,提高功能型mRNA的丰度。利用polyA+RNA,采用RT-PCR,我们成功地克隆到了轻链可变区序列,序列分析证实读码框完全正确,属于轻链可变区基因。结果NCBI数据库BLAST显示,克隆的基因序列符合小鼠Ig可变区特征,具有正确的CDR和FR功能区及VJ连接区。结论采用polyA+mRNA富集技术,成功克隆获得阻断型抗人CD154 mAb(4F1)单克隆抗体的轻链、重链可变区基因,成功地消除了SP2/0内源性畸形转录本对免疫球蛋白功能性轻链基因的影响。
- 葛彦陈永井张学光
- 关键词：假基因杂交瘤
